UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CINCIAS BSICAS DA SADE

LABORATRIO DE VIROLOGIA

PCR em Tempo Real

PCR Quantitativa (qPCR)

DOUTORANDA: TIANE MARTIN DE MOURA

PPG MICROBIOLOGIA AGRCOLA E DO AMBIENTE
1

Histrico

Descrita pela primeira vez em 1993 por Higuchi e seus

colaboradores
Acoplaram uma cmara de vdeo monitorando a PCR durante todos

os ciclos para detectar a fluorescncia

Ligao do EtBr s molculas de dsDNA recm-sintetizadas
2

Princpios da PCR em Tempo Real

Metodologia de PCR + Sistema de deteco de sinais
fluorescentes
Deteco, quantificao e amplificao de DNA em uma
nica etapa
o Agilidade na obteno de resultados

Tcnica quantitativa
o Quantificao do nmero de molculas produzidas a cada ciclo
3

Princpios da PCR em Tempo Real

Etapas de amplificao de uma PCR convencional
o Temperaturas e tempos diferentes
o Curva de dissociao

Coleta de dados
o Fase exponencial da reao

Reagentes de uma PCR convencional + Corante

o Intercalantes de DNA de dupla fita (dsDNA)
o Oligonucleotdeos marcados

Plataforma de instrumentao
o Termociclador + Sistema ptico
o Computador com software para aquisio de dados e anlise final
4

Vantagens
PCR em Tempo Real

PCR convencional

Coleta de dados na fase

exponencial
SEM manipulao psPCR
Resultados quantitativos
Requer concentraes de
DNA/cDNA 1000 x <
Tempo
de
reao
reduzido
Maior reprodutibilidade,
sensibilidade e preciso

Coleta de dados na fase final

da reao (plateau)
Manipulao ps-PCR
Preparao de gel de agarose
- visualizao
Resultados qualitativos
Requer
concentraes
maiores de DNA/cDNA
Muito tempo para obter
resultados

Aplicaes
Todas as aplicaes da PCR tradicional
Quantificao de carga viral
Quantificao de expresso gnica
Testes de eficincia teraputica
Deteco de agentes infecciosos
Caracterizao de agentes (Genotipagem)

Princpios da PCR em Tempo Real

Curva de Amplificao

Amplificao
Exponencial

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

Princpios da PCR em Tempo Real

Curva de Amplificao
Grfico de Amplificao
A2

Fluorescncia (Rn) Linear

A1

Baseline
background

Exponencial

Plateau

NTC
(no template
control)

Princpios da PCR em Tempo Real

Curva de Amplificao
Grfico de Amplificao

Fluorescncia (delta Rn) Linear

A1

A2

Exponencial
Threshold

Baseline

NTC

Ct 14,5 Ct 20,8
9

Princpios da PCR em Tempo Real

Curva de Amplificao
Fluorescncia (delta Rn) Log

Grfico de Amplificao

Exponencial

Threshold

10

Princpios da PCR em Tempo Real

Reagentes - Mix
Master Mix Comerciais
o Primers e DNA/cDNA

Mix convencional

11

Princpios da PCR em Tempo Real

Ciclagem

Tempo estimado: 00:57:34

12

Princpios da PCR em Tempo Real

Ciclagem

Tempo estimado: 00:47:37

13

Princpios da PCR em Tempo Real

Otimizao Primers
Desenho de primers (Produto de 100 150 pb)
Determinar a concentrao ideal de uso

Utilizar uma concentrao fixa de DNA/cDNA

Gradiente da concentrao dos primers
o 0,25 M; 0,4 M; 0,5 M e 0,7 M

14

Princpios da PCR em Tempo Real

Otimizao Primers
Analisar a Curva de dissociao
Melhor concentrao dos primers

Menor

concentrao

de

primers

Mxima

amplificao

15

Princpios da PCR em Tempo Real

Validao Primers
Determinar a concentrao ideal de uso
Utilizar uma concentrao fixa de primers

Gradiente da concentrao de DNA/cDNA

o 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng

16

Princpios da PCR em Tempo Real

Validao Primers
Analisar a Curva de dissociao
Valores de slope e de R2 Eficincia

Concentrao ideal dos primers (Otimizao) determinada e validada

(Validao) Reaes Padronizadas

17

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de Deteco
Deteco no-especfica
Fluorforos ligando-se ao dsDNA e emitindo fluorescncia
o SYBR-Green

Deteco especfica
Oligonucleotdeos

marcados com fluorforos altamente

especfico a sequncia alvo, emitindo fluorescncia apenas na

presena do produto de PCR de interesse
o TaqMan

18

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de Deteco
Fluorforos ou Fluorocromos
Cada molcula apresenta um espectro de absorbncia e
emisso caractersticos
SYBR-green
Absoro mxima : 494 nm
Emisso mxima : 521 nm

19

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de Deteco
TAMRA
Absoro mxima : 555 nm
Emisso mxima : 580 nm

FAM
Absoro mxima: 495 nm
Emisso mxima : 521 nm

TET
Absoro mxima : 519 nm
Emisso mxima : 539 nm

HEX
Absoro mxima : 537 nm
Emisso mxima : 556 nm

20

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de
Deteco

21

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de Deteco
Intercalantes de dsDNA green
Detecta produtos inespecficos dmeros de primers
Fluorforo disponvel em suspenso
Curva de dissociao
No permite multiplex

22

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de Deteco

corante

liga-se

imediatamente a todos os

Amplificao dos genes

O corante liga-se a cada

alvos

nova cpia de dsDNA alvo

dsDNA
23

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de Deteco
O corante liga-se a todos as molculas
de dsDNA

Quando o DNA desnaturado, o corante

dissocia-se

Incio da fase de anelamento de primers

Polimerizao completada. O corante

liga-se ao produto de dsDNA e a
fluorescncia aumenta
24

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de Deteco
Oligonucleotdeos Marcados
Detecta produtos especficos
Permite Multiplex
No necessita curva de dissociao
Sondas
o Corante reporter 5 (fluorescente) e Corante quencher 3 (silenciador)

25

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de Deteco

26

Princpios da PCR em Tempo Real

Sistemas de Deteco

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Mquinas
Eppendorf
Mastercycler ep realplex

Corbett

Stratagene

Rotor Gene 6000

Mx series

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Mquinas
Bio-Rad

Qiagen

Roche

Rotor Gene Q

LigthCycler

29

Mquinas
Applied Biosystems
7300/7500/7500 Fast/Step One/ Step One Plus

30

Mquinas
Illumina
EcoTM Real-Time PCR System

31

Eco Real-Time PCR System

32

Eco Real-Time PCR System

33

Ensaios
Quantificao Absoluta
Correlacionar o nmero de cpias virais vs. estado de
uma doena DNA/RNA

Quantificao Relativa

Analisar alteraes na expresso gnica em determinada

amostra relativa outra amostra de referncia (controle

no tratado) Transcrio - RNAm

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Quantificao Absoluta
Curva Padro
Mtodo para determinar o nmero exato de molculas
(cpias de DNA ou ng de DNA)
Determinar a concentrao inicial de uma amostra de
concentrao desconhecida a partir de uma curva padro
de concentrao conhecida
o 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng

35

Quantificao Absoluta
Curva Padro
Otimizao e Validao dos primers
Standard x Amostras Testes
Amplificao
Determinar a quantidade de alvo
Parmetros para converso de concentrao
o ng/l molculas/l

36

Quantificao Relativa
Mtodo da Curva Padro
o Exige menor quantidade de otimizao e validao

Mtodo CT Comparativo
o Semelhante ao mtodo da CP, porm utiliza-se frmulas
aritmticas
o Experimento de validao eficincia da amplificao do alvo e
do controle devero ser iguais
o Aumenta rendimento (nmero de poos na placa)
o Elimina erro de diluio das amostras

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Quantificao Relativa
Genes Alvo
o Genes de interesse

Genes Endgeno Referncia

o Gene de expresso estvel sob diferentes situaes testadas
o Normalizao de dados Correo das variaes entre amostras

38

Quantificao Relativa
Mtodo CT Comparativo Mtodo 2-Ct
Eficincia das amplificaes 90 110%

Software j calcula
Comparao dos valores CT amostras/controle

normalizados por genes endgenos

CT= CTamostra - CTreferncia
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Quantificao Relativa

Gene expression fold-change values derived from qPCR data. The changes in expression of four
genes: glucose-6-phosphate isomerase (GPI); granulysin (GNLY); granzyme B (GZMB); and granzyme H
(GZMH) in MCF-affected tissues were normalised to ribosomal protein S9 (RPS9) and plotted with
respect to equivalent tissues from control animals. Results of kidney transcript assays are in the light
columns while results of lymph node assays are in the dark columns
Russell et al 2012. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus
40
Research v169, p.246 254.

Bibliografia

Creating Standard Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA Templates for Use in
Quantitative PCR
http://www6.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf

EcoTM Real-Time PCR System User Guide http://www.illumina.com/ecoqpcr

Guide to Performing Relative Quantitation of Gene Expression Using Real-Time

Quantitative PCR. Disponvel em: http://www.gu.se/digitalAssets/1125/1125331_ABI__Guide_Relative_Quantification_using_realtime_PCR.pdf Acesso em 08 de abril de
2013.

Higuchi R et al (1993). Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification

reactions. Biotechnology Nature Publishing Company 11, 1026-1030.

Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression data using
realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T) ) method. Methods 25, 402-408.

Oliveira TMS (2010). PCR em tempo real: mtodos e aplicaes. Dissertao de

Mestrado. Universidade de Aveiro

Russell et al (2012) Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine
herpesvirus 1. Virus Research v169, p.246 254.
41

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM
MICROBIOLOGIA AGRCOLA E DO AMBIENTE

ANLISE TRANSCRICIONAL DO

PATGENO Enterococcus faecalis

VANCOMICINA RESISTENTE

DOUTORANDA: TIANE MARTIN DE MOURA (BOLSISTA CAPES)

ORIENTADORA: PROFA. DRA. ANA PAULA GUEDES FRAZZON
42

Justificativa e Objetivos
A espcie E. faecalis
Comensal potencialmente patognica
Desenvolve estratgias para detectar, responder e se adaptar a
ambientes hostis oportunista
Relevncia clnica infeces x tratamento
o Verificar o comportamento de uma cepa EVR em ambiente simulado
frente vancomicina
o Analisar a regulao in vitro de alguns genes relacionados a virulncia
o Avaliar o conjunto de transcritos gerados

43

In Vitro Evaluation of Biofilm Formation and Expression of Virulence-Related

Genes in Vancomycin Resistant Enterococcus Faecalis Isolated from Urinary

Tract Infection

44

Objetivo
Avaliar a resposta apresentada por uma cepa de E.

faecalis Vancomicina Resistente em um ambiente

simulado acrescido de urina (simulao de ITU) frente
Vancomicina
Expresso de genes relacionados a virulncia

45

Resultados e Discusso
qPCR

Fold Changes

100
80
60
tuf
40
20
0

bopA*

bopC*

vanA*

Expresso de genes de relacionados virulncia de VRE em caldo 2xYT/Urina tratados com vancomicina em
comparao ao controle (sem vancomicina) (* p 0,05).
46

Concluso
A presena de vancomicina capaz de estimular a regulao
de genes importantes na formao de biofilme

A vancomicina induz a auto-expresso do vanA

Administrao de vancomicina pode estar contribuindo para o
aumento da virulncia em isolados clnicos portanto,
extremamente necessrio ter cautela na prescrio deste
antimicrobiano
47

Obrigada!
tianedemoura@gmail.com