APLICAES DA BIOLOGIA MOLECULAR EM IMUNOHEMATOLOGIA ERITROCITRIA DRA LILIAN CASTILHO

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GENOTIPAGEM DE GRUPOS SANGUNEOS

Os sistemas de grupos sangneos so caracterizados pela presena ou ausncia de antgenos na membrana eritrocitria. Estes antgenos possuem caractersticas polimrficas bem definidas como parte integrante dos componentes da membrana. Os antgenos eritrocitrios so herdados geneticamente e definidos por seqncias de aminocidos especficas constituindo uma protena ou por carboidratos ligados a estas protenas ou a lipdios. A diversidade dos antgenos de grupos sangneos, como para qualquer outro trao biolgico, encontra-se ao nvel do gene. Existem atualmente 303 antgenos eritrocitrios distribuidos em 29 sistemas de grupos sanguneos, sries e colees, de acordo com a Nomenclatura da Sociedade Internacional de Transfuso Sangnea (ISBT). Os sistemas Rh, MNS e Kell so os mais complexos, contendo 49, 46 e 30 antgenos respectivamente (Figura 1). Os genes que codificam 28 das protenas que contm os antgenos de grupos sangneos j foram sequenciados. O gene que codifica os antgenos do sistema P, apesar de j ter sido atribudo ao cromossomo especfico, ainda no foi clonado. Os problemas que ainda no so resolvidos por testes sorolgicos podem ser agora solucionados por tcnicas moleculares. Os polimorfismos de grupos sanguneos originam-se predominantemente de mutaes de ponto, principalmente os polimorfismos de um nico nucleotdeo (SNPs) mas, recombinaes gnicas, delees e inseres tambm ocorreram ao longo da evoluo dos genes que codificam os sistemas de grupos sangneos.

Figura 1: Sistemas de grupos sanguneos (nmero de antgenos)

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A ocorrncia natural de fentipos variantes dos antgenos eritrocitrios, principalmente nos sistemas ABO, Rh e MNS, pode causar alteraes qualitativas e quantitativas na expresso dos antgenos na membrana dos eritrcitos, o que contribui para aumentar a complexidade destes sistemas. O conhecimento dos antgenos eritrocitrios essencial na prtica transfusional, uma vez que o desenvolvimento de anticorpos contra estes antgenos pode se tornar um grande problema na clnica, principalmente em casos onde os pacientes so portadores de hemoglobinopatias ou outras doenas que requerem transfuses sangneas peridicas. A utilizao das ferramentas de biologia molecular tem sido fundamental para a insero de novas metodologias na rotina laboratorial da Imunohematologia, aumentando a segurana e eficcia transfusional de pacientes politransfundidos, como os talassmicos e portadores de anemia falciforme. Isto pode ser facilmente visualizado durante os procedimentos de genotipagem de grupos sangneos, onde as tcnicas moleculares suprem as deficincias das tcnicas de hemaglutinao, principalmente na fenotipagem de pacientes com transfuso recente, quando h hemcias do doador na circulao do receptor e, em pacientes com autoanticorpos. Os testes de hemaglutinao detectam o produto do gene e a genotipagem molecular detecta o cdigo gentico, podendo ser uma excelente alternativa para os casos onde os testes de hemaglutinao no apresentam eficincia (seja devido ausncia de anti-soros comerciais de baixa incidncia ou presena de hemcias do doador ainda circulantes no receptor). Embora este mtodo tenha contribudo para importantes avanos na caracterizao molecular dos antgenos de grupos sangneos, esta poderosa ferramenta s utilizada em pequena escala, para resoluo de casos isolados. Uma vez que para cada paciente ou doador analisado, dezenas de alelos diferentes devem ser pesquisados para garantir a eficincia da anlise, o que desencadeia a execuo de diversas tcnicas de PCR para cada amostra. A alternativa para a resoluo pontual destes conflitos seria a aplicao de tcnicas moleculares que permitem o trabalho em larga escala (tecnologia Microarray), ou seja, a triagem automatizada dos SNPs de grupos sanguneos em doadores de sangue, possibilitando uma compatibilidade exata entre doadores e receptores.

O uso da tecnologia Microarray para genotipagem em larga escala, atravs da elucidao de SNPs, pode fornecer importantes informaes sobre o perfil molecular completo dos antgenos eritrocitrios de grupos sangneos. Uma vez que, diante do grande nmero de amostras analisadas, maiores sero as chances de serem encontrados novos SNPs e ou mutaes nos genes que codificam estes antgenos, aumentando desta forma, o conhecimento cientfico das bases moleculares dos sistemas de grupos sangneos e o perfil destes genes nas diferentes populaes. A genotipagem de grupos sangneos em larga escala pode tambm ser til para a criao de bancos de dados eletrnicos de doadores com caractersticas raras, o que permitiria a troca de amostras de sangue fenotipado entre os bancos de sangue associados, possibilitando a identificao de doadores mais compatveis com os pacientes em tempo reduzido, permitindo a determinao de vrios polimorfismos em uma nica reao com reduo de tempo e custo. O objetivo desta apostila apresentar os mecanismos moleculares responsveis pelo aparecimento dos antgenos associados aos fentipos de grupos sangneos; mostrar as aplicaes das tcnicas moleculares em Imunohematologia e discutir os problemas clnicos que potencialmente podem ser resolvidos.

INTRODUO A GENTICA MOLECULAR

Gene Seqncias de DNA que contm o cdigo gentico
para sntese de protenas, composto de regies que codificam aminocidos (exons) e regies no traduzidas em aminocidos (introns). O genoma humano consiste de 46 cromossomos: 22 pares de autossomos e 1 par de cromossomo sexual (XX em mulheres e XY em homens). Um cromossomo uma longa fita de DNA que contm o cdigo gentico do indivduo.

Polimorfismo Mudana (substituio ou deleo) de parte

do gene (nucleotdeo, codon ou seqncias maiores) e conseqente alterao da protena para o qual codifica. No processo de traduo do cdigo gentico em protena, o DNA transcrito em RNA primrio e os introns so removidos por um processo especfico denominado splicing (regio de ciso de intron) para gerar o RNA mensageiro (mRNA). O mRNA ento traduzido por um ribossomo em sries de aminocidos para formar uma protena.

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Cada trs bases (codon) na fita de mRNA codifica um aminocido (ex.: AAG o codigo para lisina enquanto AAC o codigo para asparagina) ou um sinal de terminao (UAA, UAG, UGA).

MECANISMOS MOLECULARES ASSOCIADOS COM OS GRUPOS SANGNEOS

O sequenciamento dos genes que codificam os sistemas de grupos sangneos levou a um grande progresso no entendimento dos mecanismos moleculares associados diversidade dos antgenos de grupos sangneos. Estes mecanismos so substituies de um nico nucleotdeo (SNPs); deleo; insero; mecanismos de splicing alterados; crossing over intragnico; crossing over intergnico; converso gnica ou outros rearranjos gnicos.

Propriedades do DNA O DNA composto de 2 fitas

de nucleotdeos pareadas e entrelaadas de forma a compor a famosa dupla hlice. Cada fita de DNA composta de apenas 4 nucleotdeos (bases), sendo duas purinas: adenina (A) e guanina (G) e duas pirimidinas: citosina (C) e timina (T). Estas bases se alinham de forma especfica e complementar: G C e A T. O cdigo gentico determinado pela seqncia destas 4 bases ao longo da fita de DNA. O estado inicial do DNA uma fita dupla. Durante o processo biolgico de duplicao do cromossomo, que antecede a diviso celular, e na transcrio do gene em RNA, que antecede a sntese protica, as fitas de DNA se separam (desnaturao) para serem copiadas. Aps este evento (transcrio ou duplicao do cromossoma) o DNA retorna ao estado nativo (as fitas se hibridizam novamente). O processo de desnaturao observado nas situaes biolgicas acima mencionadas, pode ser induzido in vitro, por tratamento do DNA com soluo alcalina ou por aquecimento. E assim, como na situao biolgica, o processo de desnaturao revertido por correo do pH ou reduo da temperatura.

SNPs (polimorfismos com substituio de um nico nucleotdeo):

Substituio de um nico nucleotdeo na regio codificadora do gene (por exemplo um G para um A). Esta substituio pode determinar trs efeitos: 1. nenhuma alterao no aminocido determinado pelo codon (mutao silenciosa); 2. uma mudana na identidade do aminocido codificado (mutao missense) e 3. converso de um codon que especifica um aminocido em um codon de terminao (mutao sem sentido de transcrio ou nonsense). A maioria dos antgenos de grupos sangneos antitticos surge de mutaes missenses. Exemplos de mutaes nonsenses so os sistemas Duffy e o Colton.

Deleo: Perda de um nico nucleotdeo ou um segmento de DNA.

Uma deleo de nucleotdeos em mltiplos de trs na seqncia do DNA (in frame) alterar o codon de traduo e resultar na ausncia de um ou mais aminocidos e, provavelmente, codificar uma protena com caractersticas diferentes. Uma deleo de trs nucleotdeos no seqenciais na estrutura do DNA (out of frame), ou em mltiplos outros que no trs (1, 2, 4, etc.), resultar na alterao de toda a seqncia do mRNA. Uma nova seqncia de aminocidos e um novo stop codon (codon de terminao) e, consequentemente determinar a produo de uma protena mutante inativa. Alguns fentipos de grupos sangneos nulls surgem em conseqncia da deleo de nucleotdeos, exons ou gene. Exemplos: Jk(ab), U e D--.

Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) A tcnica de PCR

utiliza os princpios de Hibridizao especifica, Orientao definida, Desnaturao e Restaurao ao estado nativo para aumentar uma seqncia especifica de um gene. Na tcnica de PCR, para amplificao de um segmento especfico de DNA, primers (oligonucleotdeos sintticos) ou sondas alelo-especficas so utilizados na reao de cadeia. Cada ciclo de amplificao consiste de: 1. Desnaturao da dupla fita de DNA por aquecimento; 2. Hibridizao dos primers com a utilizao de uma seqncia especfica de nucleotdeos da fita de DNA complementar (anelamento); 3. Extenso dos primers pela ao da Taq DNA polimerase atravs da adio de nucleotdeos livres complementares fita de DNA original. A seguir, a nova dupla fita de DNA formada serve como fita original para os subsequentes ciclos, gerando assim uma escala geomtrica de amplificao.

Insero: Adio de um nico nucleotdeo ou segmento de DNA.

A semelhana da deleo a insero de um nucleotdeo numa determinada seqncia de DNA podem causar uma alterao no codon de traduo do DNA. Exemplo: Co(ab).

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Splicings alterados: A remoo de introns (outsplicing) um

processo bem definido. Este processo obedece sinais codificados por motivos especficos chamados de stios de splice. O sitio doador de splice sempre a seqncia GT e corresponde aos dois primeiros nucleotdeos da regio 5 de cada intron. O sitio receptor de splice sempre a seqncia AG e corresponde aos dois ltimos nucleotdeos da regio 3de cada intron. Em alguns casos, os dois ltimos nucleotdeos da regio 3do exon tambm podem estar envolvidos neste processo. Uma mudana de um nico nucleotdeo em um destes stios, pode alterar o splicing de forma a gerar a retirada do exon anterior ou posterior ao sitio, dependendo se esta mutao ocorreu no sitio doador ou receptor de splice. O fentipo Jk(ab) um exemplo deste mecanismo.

Converso gnica e outros rearranjos: Processo de reparo

do DNA que ocorre durante a primeira diviso da meiose. Na fase de recombinao, fitas duplas de DNA so formadas como uma conseqncia de pareamento e recombinao entre alelos no idnticos nos dois cromossomos. A converso gnica ocorre quando o sistema de reparo do DNA remove uma das fitas de uma regio no apropriadamente pareada e a corrige de acordo com a fita de DNA restante. Uma vez que somente uma fita de DNA envolvida neste processo, o produto no tem um parceiro recproco. Em grupos sangneos, a converso gnica foi descrita nos sistemas Lu, MNS e Rh. Outros rearranjos incluem complexos hbridos nos quais os mecanismos envolvidos no foram ainda determinados.

Translocao cromossmica: Transferncia de segmento

de um cromossomo para outro cromossomo no homlogo. Isto, pode ocorrer em certas doenas (leucemia, linfoma e fibrose mieloproliferativa), onde partes de um cromossomo so realocadas em outro cromossomo. Exemplos de antgenos de grupos sangneos que podem ser alterados por este mecanismo so: A, B, H, D, M e N.

ANLISES MOLECULARES

Crossing over: Troca recproca de partes de um gene entre

cromossomos homlogos. Isto, pode ocorrer durante a meiose, se o mesmo gene tiver reas homlogas alinhadas (crossover intragnico) ou se dois genes altamente homlogos desalinham (crossover intergnico). O crossing over intragnico foi descrito no gene GYPC que pode apresentar um gene com dupla cpia do exon 2 ou um gene com duas cpias do exon 3. Os produtos recprocos so genes que perdem o exon 2 ou o exon 3. O crossing over intergnico ocorre nos sistemas de grupos sangneos MNS, Rh e Ch/Rg, que so codificados por 2 genes homlogos adjacentes num mesmo cromossomo. Vrios exemplos no sistema MNS aparecem em arranjos Lepore e anti-Lepore. Genes Lepore tipo hbridos surgem em um cromossomo sem a presena dos genes nativos. Ao contrrio, os genes anti-Lepore hbridos ocorrem num cromossomo entre uma cpia dos genes pais. Em ambos os casos, novas seqncias de aminocidos na juno das protenas hbridas so reconhecidas como antgenos de grupos sangneos discretos.

A genotipagem molecular pode ser realizada sempre que a seqncia de um gene for conhecida e que as mutaes responsveis por um antgeno ou fentipo de grupo sangneo tenham sido determinadas. Os protocolos de PCRs comumente utilizados na determinao de antgenos de grupos sangneos so: primers alelo-especficos (AS-PCR) e PCR seguido por anlises dos fragmentos com enzimas de restrio (PCR-RFLP). Atualmente tem merecido destaque tambm a tcnica de Microarray ou tecnologia Chip, por possuir uma plataforma rpida de genotipagem (diversas amostras ao mesmo tempo) com excelente descriminao allica, reduo no nmero de procedimentos isolados (execuo de um nico PCR multiplex) e resultado altamente automatizado.

Tcnica de PcR alelo-esPecfica

A tcnica de PCR alelo-especfica utiliza dois diferentes primers, requerendo assim duas amplificaes independentes. Devido a isto, torna-se importante monitorar a eficincia da amplificao, realizandose uma co-amplificao de uma seqncia no relacionada como um controle interno. A amplificao de um controle interno indica a ausncia de substncia inibidora no tubo da reao (Figura 2). Os protocolos alelo-especficos necessitam de cuidado e ateno. Eles podem no ser eficientes quando dois alelos diferem em apenas um nucleotdeo. Este mtodo tem grande aplicao na tecnologia Chip.

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Figura 2: Produto de PCR alelo especfico aps eletroforese em gel de agarose

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Painel A Representao esquemtica das seqncias amplificadas

dos alelos FY B e FY A. Os tamanhos dos fragmentos obtidos na diferenciao dos dois alelos aps digesto com a enzima de restrio Ban I. As localizaes dos stios comuns presentes apenas no alelo FY A esto representadas por uma caixa sobre a barra representando a seqncia.

Painel B Fotografia de um gel de poliacrilamida aps eletroforese

do produto de PCR submetido a digesto enzimtica. Pista 1 Marcador molecular (100 pb ladder). Pista 2 O produto amplificado no tratado com a enzima Ban I. Pista 3 Padro observado do produto amplificado de amostra homozigota para FY A (FY A/FY A) tratado com a enzima Ban I. Pista 4 Padro observado do produto amplificado de amostra homozigota para FY B (FY B/FY B) tratado com a enzima Ban I. Pista 5 Padro observado do produto amplificado de amostra heterozigota (FY A/FY B) tratado com a enzima Ban I.

Tcnica de PcR-RflP
A tcnica de PCR-RFLP s pode ser realizada quando a mutao polimrfica estiver associada com a alterao (produo ou remoo) de um stio de enzima(s) de restrio. A vantagem deste procedimento possibilitar a amplificao concomitante de ambos alelos com um nico par de primers. Assim, uma reao positiva (produto de PCR amplificado) observada com ambos os alelos, que servem como um controle interno. A diferenciao dos alelos feita depois da digesto do produto de PCR com uma enzima de restrio, capaz de identificar a mutao de ponto e, aps eletroforese, para a melhor visualizao do tamanho dos fragmentos (Figura 3).

Tcnica de MicRoaRRay
A tcnica de Microarray utiliza um PCR multiplex que possibilta a anlise de vrios polimorfismos simultaneamente e sondas de oligonucleotdeos depositadas em uma placa (vidro, slica ou outros suportes) marcadas com fluorescncia e hibridizadas com DNAs alvo (amplificados atravs do PCR multiplex), gerando um espectro de cor (caso haja a hibridizao) que detectado e interpretado por um sistema automatizado capaz de avaliar a intensidade das hibridizaes e fornecer resultados que podem ser visualizados na forma de grficos ou tabelas de gentipos (Figuras 4 e 5). A rapidez e a confiabilidade de resultados proporcionados por esta tecnologia aumentaro a exatido da compatibilidade entre doador e receptor, bem como a segurana das transfuses.

Figura 3: Diferenciao dos alelos pelo tamanho dos fragmentos em gel de poliacrilamida aps digesto enzimtica

Painel A
FY B 306 BAN I Sitio comum 210bp BAN I Sitio 86 bp 86 1 2

Painel B
3 4 5 392 306 210

FY A 96 bp BAN I Novo sitio

96 86

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Figura 4: Esquema do Microarray (BeadChipTM, Bioarray Solutions)

Sistema de imagem automtica Desenvolvimento do ensaio Produo da partcula e funcionalizao

EFICINCIA DA AMPLIFICAO DO DNA

a. Qualidade e quantidade de DNA Considerando que a

A eficincia da amplificao do DNA pode ser afetada por dois fatores: a. qualidade e quantidade de DNA; b. Condies fsico-qumicas.

BeadChip tM

qualidade e a quantidade do DNA so crticas para a amplificao extremamente importante realizar anlises qualitativas e quantitativas dos DNA(s) extrados. A quantidade de DNA determinada pela leitura de densidade ptica seguido do seguinte clculo: concentrao de DNA = absorbncia a 260nm x diluio x 50 (fator para DNA) em g/ml. Alternativamente, a quantidade de DNA pode ser estimada atravs da comparao com padres de concentraes conhecidas aps eletroforese em agarose, enquanto que a qualidade pode ser avaliada atravs da corrida do DNA em gel de agarose 1% corado com brometo de etdio (Figura 6).
Software

Figura 6 Anlise qualitativa de DNA em gel de agarose a 1%

1 Protocolo de automao 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Placas de MultiChip

Figura 5: Anlise dos dados (BeadChipTM, Bioarray Solutions)

10000 8000 6000 4000 2000 0

B IA 323 350 703 FYB 265 ATA /D CO G A/ DIB DO- DO- DO- FYA/ FY CO S 3 2 2 B B B A GP GPB A/JK K1/K A/LU /LW 1/SC S17 JK HB LU LWA SC

Pista 1 - marcador molecular Pista 2 - DNA extrado de clula bucal Pista 3 e 4 - DNA degradado Pista 5 Padro 100 ng Pista 6 e 7 Pobre em DNA Pista 8 DNA em baixa concentrao Pista 9 DNA em boas condioes Pista10 DNA em baixa concentrao Pista 11 e 12 DNA degradado

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A eficincia de amplificao de seqncias longas mais vulnervel em amostras de DNA degradado do que a amplificao de seqncias mais curtas. O balano da quantidade de DNA importante pois DNA em excesso pode resultar em amplificao inadequada. Em amostras contendo DNA degradado aconselhavel a comparao da intensidade da banda correspondente ao DNA genmico na estimativa da quantidade de DNA a ser usada por reao.

APLICAES CLNICAS DA GENOTIPAGEM MOLECULAR

1. Identificao de risco na Doena Hemoltica Peri-Natal (DHPN) Testes de hemaglutinao, incluindo a titulao de
anticorpos anti-eritrocitrios, do apenas uma indicao indireta da possibilidade de ocorrncia da DHPN. Este fato, ocorre particularmente nos casos de mes com anticorpos dirigidos antgenos do sistema Kell. Apesar do gentipo fornecer informaes diretas, os critrios para obteno dos amnicitos devem ser bem estabelecidos. A genotipagem indicada nos casos em que a me possui um anticorpo da classe IgG clinicamente significante e o pai heterozigoto para o antgeno em questo ou desconhecido. Atualmente possvel realizar a genotipagem fetal atravs da amostra de plasma materno (mtodo no invasivo para o feto), pois foi demonstrado que o DNA fetal livre encontrado na circulao materna, cuja concentrao aumenta durante a gestao, pode ser utilizado para realizao da genotipagem de grupos sanguneos. A possibilidade de realizar genotipagem RHD fetal atravs do plasma materno ter um grande impacto na identificao das gestantes RhD-negativo que necessitam de imunoglobulina Rh e tambm no monitoramento da gestao de mes sensibilizadas pelo antgeno RhD que esto gerando um feto RhD positivo.

b. Condies fsico-qumicas: A eficincia da amplificao

de DNA pelo PCR diretamente influenciada por fatores como a concentrao dos reagentes (MgCl2, primers, enzima e seu tampo) e pelo nmero e condies dos ciclos de amplificao. Portanto, h necessidade da incluso de um controle interno na realizao deste procedimento. A otimizao das condies do PCR ainda mais crtica quando as amostras de DNA a serem analisadas apresentaro concentraes baixas e/ou qualidade inadequada. A Figura 7 mostra a eficincia da amplificao comparada com a qualidade de DNA e o tamanho do produto amplificado para determinao de antgenos Kell (K/k). Nos gis 1 (PCR) e 2 (RFLP), o produto amplificado de 720 pares de base (bp). Nos gis 3 (PCR) e 4 (RFLP) o produto amplificado de 156 bp. A mesma amostra de DNA (pobre em qualidade) foi utilizada nas pistas 2 (PCR), 9 (RFLP), 14 (PCR) e 19 (RFLP). O efeito da qualidade do DNA na amplificao foi amenizado pela reduo do tamanho do produto amplificado.

2. Teste direto da antiglobulina positivo Nas situaes

em que as hemcias esto revestidas com anticorpos da classe IgG, a genotipagem tem um papel importante na determinao dos antgenos de grupos sanguneos, pois a maioria dos antisoros utilizados para a fenotipagem so reativos pelo teste da antiglobulina. A utilizao da genotipagem nestes casos pode auxiliar na determinao do perfil antignico do paciente e possibiltar a realizao de transfuso fentipo compatvel.

Figura 7: Eficincia da amplificao comparada com a qualidade de DNA e o tamanho do produto amplificado
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

3. Pacientes com transfuso recente - Estudos mostram que

a presena de leuccitos nos produtos de sangue transfundidos no interfere na genotipagem de grupos sanguneos. Assim, pacientes politransfundidos com transfuso recente podem ser genotipados para determinao do seu perfil antignico, possibilitando transfuses fentipo compatvel.

4. Processo de identificao de anticorpos A genotipagem

pode ser um mtodo de auxilio na identificao de anticorpos de pacientes politransfundidos, pois atravs dela possvel deduzir o fentipo e confirmar a suspeita do aloanticorpo presente.

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5. Confirmao de discrepncias ABO e Rh Algumas situaes

clnicas e a utilizao de diferentes anti-soros nas rotinas de Imunohematologia podem levar a discrepncias nos fentipos ABO e Rh. Estas discrepncias podem atualmente ser facilmente solucionadas atravs dos testes moleculares que independem da disponibilidade de soros para a confirmao do fentipo presente.

LIMITAES

6. Determinao da zigozidade do antgeno RhD A zigozidade

do antgeno RhD, impossvel de ser determinada sorolgicamente, pode ser realizada por tcnicas moleculares. Esta genotipagem tem sido de grande auxlio na identificao da zigozidade RhD em pais de fetos gerados por mes RhD-negativo e na constituio dos painis de hemcias.

Apesar da genotipagem complementar os testes de hemaglutinao, o gentipo de uma pessoa pode no correlacionar com o fentipo. Portanto, os resultados devem ser cuidadosamente interpretados, principalmente na aplicao clnica. Existem situaes onde a genotipagem detecta a presena de um gene que no expresso e, portanto, a protena no vai para a superfcie das hemcias. Exemplos:

1. Fentipos nulls de grupos sangneos como Rhnull, K0, Fy

(ab), Jk(ab), LW(ab) e o fentipo Leach possuem um gene aparentemente normal, mas a protena que carreia o antgeno no expressa. H tambm alguns antgenos de grupos sangneos que s so expressos se uma protena de interao codificada por outro gene for co-expressa. Neste caso, as protenas esto ausentes das membranas das hemcias como uma conseqncia de uma mutao no gene que codifica uma protena de interao. Mudanas no gene XK enfraquecem a expresso dos antgenos do sistema Kell; mudanas no gene que codifica a glicoprotena Rh (Rh50) impedem RhD e RhCE de interagirem na membrana da hemcia e assim, os antgenos Rh no so expressos; mudanas no gene que codifica a Protena 4.1 resultam na perda da Glicoforina C da membrana e, consequentemente, no enfraquecimento dos antgenos Ge (Figura 8).

7. Determinao de antgenos fracos Antgenos fracamente

expressos na membrana eritrocitria como Fyx, evar e outros podem ser seguramente determinados pela genotipagem.

8. Confirmao dos antgenos D fraco e D parcial

A genotipagem tem sido de grande auxlio na confirmao dos antgenos D fraco e D parcial, bem como na determinao dos tipos de D fraco e tipos e categorias de D parcial, muitas vezes impossvel de identificar sorologicamente.

9. Determinao de microquimerismo em pacientes transplantados possvel selecionar um marcador gentico

de grupos sanguneos atravs da genotipagem eritrocitria em doadores e receptores de transplante de medula ssea e avaliar o quimerismo aps o transplante.

2. Existem tambm protenas que so expressas em baixo nmero

de cpias e portanto so difceis de deteco como por exemplo o antgeno Fyx (Figura 9).

3. Molculas hbridas formadas a partir de genes idnticos que

desalinham durante a meiose podem levar a resultados falsopositivos ou falso-negativos se os primers selecionados hibridizarem a rea envolvida. A anlise por PCR demonstra a presena de uma pequena parte do gene e no necessariamente informa se o gene inteiro est presente ou se o antgeno expresso. A Figura 10 mostra a formao de um gene hbrido no sistema MNS.

10. Testes em medicina legal Paternidade e testes forenses

podem ser realizados atravs da genotipagem molecular com maior chance de resoluo.

11. Disponibilidade de sangue para pacientes dependentes de transfuso A genotipagem molecular tem sido utilizada
para identificar pacientes com fentipo Fy(b) que podem ser transfundidos com hemcias Fy(b+) sem o risco de desenvolverem anticorpos anti-Fyb. Dois teros da populao Africana com fentipo Fy(ab) possuem o gene FYB com uma mutao no promotor eritride (GATA-1) que leva a ausncia de expresso da protena Duffy e, consequentemente, do antgeno Fyb na superfcie das hemcias. No entanto, a protena expressa em outros tecidos, como por exemplo, nas clulas do endotlio de vasos sangneos.

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Figura 8: interao de protenas na membrana do eritrcito

Wrb Band 3 S Band 3 XK S Kell GPA GPA Rh

Wrb

COMENTRIOS

Rh

RhAg

RhAg

Protein 4.1

Pelo fato dos antgenos de grupos sangneos estarem presentes na parte externa da membrana eritrocitria eles so extremamente importantes na medicina transfusional, uma vez que a perda de um antgeno pode levar aloimunizao de um indivduo aps transfuso de hemcias com o respectivo antgeno e aumentar seu risco transfusional nas transfuses subseqentes. Os testes pr-transfusionais tm historicamente evitado estas reaes transfusionais, que podem variar de moderada a fatal. Recentemente, os avanos tecnolgicos em diagnstico molecular tm permitido identificar a presena ou ausncia de uma determinada seqncia gnica que codifica para uma protena especfica. As fontes de DNA alternativas aos leuccitos, tais como: clulas epiteliais do trato urinrio e da mucosa bucal so de grande valor em pacientes dos quais no se consegue coletar sangue. No entanto, importante lembrar que se um paciente tiver sido transplantado com clulas alognicas ou stem cells, pode ocorrer discrepncia entre os resultados dos gentipos realizados em DNAs obtidos de diferentes fontes. Por exemplo, o resultado da genotipagem com DNA de leuccitos pode ser diferente do daquele obtido com o DNA de clulas bucais ou sedimento urinrio. Portanto, fundamental obter a histria clnica do paciente antes de selecionar adequadamente a fonte de DNA para a genotipagem. A tcnica de PCR extremamente sensvel, por isso, o risco de contaminao grande e cuidados para evitar a contaminao devem ser rigorosamente observados. A rea designada para preparo da amostra e pr-amplificao deve ser separada da rea de anlise ps-amplificao. Estantes, pipetas, ponteiras, tubos e solues no devem ser transportados de uma rea para outra. Os reagentes utilizados no PCR devem ser armazenados congelados em alquotas. Quando h suspeita de contaminao deve-se desprezar os reagentes em uso e iniciar o procedimento com novas alquotas. Recomenda-se tambm desinfetar periodicamente as estantes, pipetas, centrfugas. A possibilidade de realizar genotipagem em conjunto com hemaglutinao muda a gama de possibilidades nos procedimentos transfusionais, aumentando assim a segurana dos pacientes transfundidos. No entanto, importante lembrar que a deteco de um gene atravs das tcnicas de genotipagem molecular no significa necessariamente que a protena carreando o antgeno ser expressa. Assim, resultados falso-negativos e falso-positivos podem ocorrer. Resultados falso-negativos (com hbridos) so problemas: 1. na anlise pr-natal, uma vez que a me pode no receber o acompanhamento necessrio, o feto de risco no ser identificado; 2. na determinao de grupo sangneo de doador e um sangue positivo para o antgeno pode ser selecionado para um paciente que possui o anticorpo correspondente.

XK

Kell

Protein 4.1

Figura 9: interao de protenas na membrana do eritrcito

Arg

Cys (Ala Thr)

Arg

Cys (Ala Thr)

Figura 10: Formao de gene hbrido (GYPA/GYPB) aps crossing over

GYPA GYPA

GYPA

GYPB

GYPA

GYPB

GYPA

GYPB

GYPA

GYPB

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AplicAes dA BiologiA MoleculAr eM iMunoheMAtologiA eritrocitriA

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Os resultados falso-positivos so problemas na determinao de grupos sangneos de pacientes, uma vez que eles podem receber sangue contendo o antgeno. A genotipagem de grupos sanguneos pode contribuir, substancialmente, na qualidade da transfuso de sangue fenotipado, sobretudo em pacientes politransfundidos. No entanto, para se estabelecer protocolos seguros de genotipagem de grupos sanguneos importante realizar uma triagem sistemtica dos alelos e variantes de uma determinada populao. Um dos principais objetivos deste estudo substituir com segurana as tcnicas sorolgicas atualmente empregadas nas rotinas de bancos de sangue. Embora muitos pesquisadores estejam trabalhando neste contexto, poucos dados foram publicados e vrias populaes ainda permanecem um mistrio quanto a sua diversidade gentica de grupos sanguneos. A tecnologia baseada em microarrays tem sido avaliada para deteco de polimorfismos de grupos sanguneos. A esperana que esta metodologia permita a realizao da genotipagem de grupos sanguneos em larga escala de forma automatizada e rpida e que possa ser utilizada nas rotinas dos bancos de sangue. Embora seja pouco provvel que a genotipagem molecular venha substituir a hemaglutinao nos prximos anos. Estas tcnicas utilizadas em conjunto tm um valor potencial importante na segurana transfusional e materno-fetal (Figura11). Apesar da genotipagem complementar os testes de hemaglutinao, o gentipo de uma pessoa pode no correlacionar com o fentipo. Portanto, os resultados devem ser cuidadosamente interpretados, principalmente na aplicao clnica. Existem situaes onde a genotipagem detecta a presena de um gene que no expresso e, portanto, a protena no vai para a superfcie das hemcias. Exemplos:

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Figura 11: Testes moleculares caminham lado a lado com a hemaglutinao

Amostra do paciente

Anlise sorolgica

Resolvido? Sim Resultado Final

No

Anlise molecular Resolvido? Sim No

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