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(NGS)
INÍCIO DO SEQUENCIAMENTO
Placas
Illumina
Características
Atualmente o padrão-ouro para muitas das análises de NGS.
Utiliza como base o sequenciamento por síntese (SBS).
Três linhas de equipamentos: MiSeq, NextSeq e HiSeq.
Leituras de 36 bp nas primeiras versões, e agora de 150x2 em HiSeq e 300x2 em
MiSeq.
Vantagens: Metodologia extremamente versátil e barata, Grande variedade de
protocolos para sequenciamento e análise de dados, Padrão da indústria.
Desvantagem: Problema em regiões com extremo de conteúdo GC (GC%).
Utilização: Utilizadas em vários estudos com diferentes objetivos e em diferentes
organismos. Como exemplo temos o sequenciamento de DNA microbiano,
montagem de novo de genes expressos em Eucalyptus, sequenciamento do
genoma mitocondrial de baleias, moluscos e humanos, detecção de SNPs em
dados de sequenciamento, entre centenas de outros estudos.
Como funciona o método
Os fragmentos de DNA da amostra são ligados aos adaptadores em ambas às
extremidades, o que permite sua fixação à lâmina de sequenciamento por hibridização a um
dos oligonucleotídeos fixados no suporte. Após o passo de amplificação pela PCR em ponte,
uma superfície de sequenciamento (flowcell- placa de vidro) possui mais de 300 milhões de
aglomerados (clusters), onde cada aglomerado é composto por cerca de 1000 cópias clonais
de uma única molécula. As moléculas de DNA clonadas nos clusters são sequenciadas de
forma paralela utilizando uma abordagem de síntese de DNA que emprega nucleotídeos
especiais contendo terminador reversível e radical fluorescente com porção removível. A
incorporação desses nucleotídeos impede que novas bases sejam incorporadas até que o
terminador seja removido. A DNA polimerase utilizada também foi modificada para permitir a
incorporação destes nucleotídeos modificados. Os nucleotídeos são marcados com
fluorescência, sendo quatro cores diferentes para distinguir entre as diferentes bases. A
posição e a sequência molde de cada cluster são deduzidas pela leitura da cor identificada em
imagens de alta resolução obtidas a cada passo de adição dos nucleotídeos.
VÍDEO
https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
Ion Torrent
A reação de polimerização gera naturalmente um H3+ , ou seja, um próton, que altera o pH do meio.
Essa alteração do pH é detectada por um transistor e convertida em um sinal elétrico
Representação dos sinais detectados pelo sensor de um único poço
Características
- GIUSTI, J.; KETTENER, K.; FERRAZ, M.C.P.F. Influência do sequenciamento de nova geração no futuro da
genética da conservação. Disponível
em:<http://www.recursosgeneticos.org/Recursos/Arquivos/15._Influ_ncia_do_sequenciamento_de_nova_gera_o
_no_futuro_da_gen_tica_da_conserva_o.pdf>. Acesso em: 25 Abril de 2018.
- PINTO, L.S.; KREMER, F.S. Capítulo 3. Plataformas de Sequenciamento de Nova Geração & Pré-
processamento de dados. Disponível em:<labbioinfo.ufpel.edu.br/aulas_2016/Capitulo%203.docx>. Acesso
em: 25 Abril de 2018.