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SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO

(NGS)
INÍCIO DO SEQUENCIAMENTO

 O DNA teve sua estrutura química desvendada


em 1953.

 O sequenciamento de DNA iniciou-se nas


décadas de 70 – 80, por Maxam e Gilbert,
Sanger.
Terminadores de corante
(Next Generation Sequencing)
Diversas plataformas de NGS foram desenvolvidas,
baseadas principalmente nas metodologias de:

 Pirosequenciamento com detecção de pirofosfato (454 – Roche);


 Sequenciamento por ligação (SOLiD);
 Metodologia de semicondutores (Ion);
 Sequenciamento por síntese (Illumina);
 Sequenciamento de moléculas únicas (Pacific Biosciences e o
Oxford Nanopore).

OBS: A escolha do método depende principalmente do objetivo do trabalho proposto. Grande


parte destas tecnologias ainda está em desenvolvimento e constante aprimoramento.
 Sequenciamento de Primeira Geração
Degradação química – Maxam & Gilbert
Interrupção da cadeia (ddNTPs) - Sanger
 Sequenciamento de Segunda Geração
454 - Roche
Illumina - HiSeq/MiSeq
SOLiD
 Sequenciamento de Terceira Geração
Ion Torrent – ABI - Life Technologies
PacBio RS – Pacific Biosciences
 Sequenciamento de Quarta Geração
Nanopore - GridIon/MiniIon
 Sequenciamento de Primeira Geração
Degradação química – Maxam & Gilbert
Interrupção da cadeia (ddNTPs) - Sanger
 Sequenciamento de Segunda Geração
454 - Roche
Illumina - HiSeq/MiSeq
SOLiD
 Sequenciamento de Terceira Geração
Ion Torrent – ABI - Life Technologies
PacBio RS – Pacific Biosciences
 Sequenciamento de Quarta Geração
Nanopore - GridIon/MiniIon
454 Roche
Etapas envolvidas:

1) Fragmentação do DNA molde


2) PCR em emulsão
3) Transferência para os
nanopoços
4) Identificação da sequência
através de picos luminosos pela
adição de cada nucleotídeo
MECANISMO DE DETECÇÃO
MECANISMO DE DETECÇÃO

A DNA polimerase incorpora a base correta à sequência liberando pirofosfato.


A ATP sulfurilase converte o pirofosfato em ATP na presença de adenosina 5’ fosfosulfato (APS).
O ATP age como combustível para a conversão de luciferina em oxiluciferina mediada pela enzima
luciferase, que gera uma quantidade de luz visível proporcional à quantidade de ATP.
Características
 Primeira plataforma de Next Generaton Sequencing (NGS) a ser comercializada,
lançado em 2005 pela empresa Roche. O 454 é capaz de produzir 25 milhões de pb
com precisão de 99% de 4-5horas na máquina.
 Utiliza como base o pirosequenciamento - é uma técnica que tem como princípio a
detecção de um pirofosfato liberado durante a incorporação do nucleotídeo à cadeia.
 Vantagens: com relação a demais tecnologias de sequenciamento essa plataforma
produz maiores leituras e por isso tem sido mais utilizada, leituras longas possibilita o
mapeamento de regiões repetitivas do DNA, curto tempo de corrida.
 Desvantagens: alto custo de reagentes e equipamento, sequências pequenas e de
difícil análise, ou seja, as leituras são relativamente menores (~250pb) que as
obtidas pelo método de Sanger (750 bp).
 Aplicações: sequenciamento de novo (seq. de genomas desconhecidos) como em
bactérias e genomas eucariotos, e outros.
Como funciona o método
O sequenciador desenvolvido pela Roche, denomina-se 454, utilizando o método
conhecido como pirosequenciamento. O pirosequenciamento baseia-se pela fragmentação do
DNA molde, depois ocorre a ligação de sequências adaptadoras (A e B) nas extremidades de
cada fragmento gerado, onde são utilizados dois adaptadores diferentes um para cada
extremidade da fita (5’ e 3’), depois ocorre uma separação das fitas de DNA duplo em uma fita
de DNA simples. Depois ocorre ligação das sequências adaptadoras na sequência da
microesfera (também chamado de beads, nanoesferas), ou seja, as microesferas possuem
sequências que pareiam com as sequências adaptadoras. Espera-se que apenas uma
sequência se ligue a cada microesfera. O próximo passo após ocorrer a ligação do DNA as
microesfera é a amplificação, que no caso do pirosequenciamento, essa amplificação será
realizada em uma solução oleosa emulsificada, denominada PCR em emulsão. Desse modo,
as microesferas serão internalizadas por gotículas de óleo e a única fita de DNA ligada à
microesfera dará origem a várias outras fitas, que também se ligarão a essas microesferas.
Desta forma, cada microesfera ficará coberta por milhares de cópias de uma única sequência
de DNA.
Como funciona o método

Realizado o processo de amplificação a solução é transferida para uma placa contendo


milhões de nanopoços que possuem diâmetro suficiente para apenas uma microesfera. Após
isso, os reagentes da reação de sequenciamento são adicionados, sendo os reagentes
utilizados, neste caso, as enzimas DNA polimerase, ATP sulfurilase e luciferase. A DNA
polimerase adicionará um nucleotídeo por vez, liberando um pirofosfato (PPi), que será
convertido em ATP pela ação da enzima ATP sulfurilase. O ATP gerado será utilizado pela
enzima luciferase para converter a luciferina em oxiluciferina, um processo que liberará luz.
Em cada nanopoço está ocorrendo milhares de reações ao mesmo tempo, sendo que uma
câmera é responsável por filmar a placa e enviar todos os dados para o computador, que irá
fazer a identificação da sequência de cada nanopoço, através da análise dos picos luminosos
gerados pela adição de cada nucleotídeo.
VÍDEO
https://www.youtube.com/watch?v=KzdWZ5ryBlA
Illumina

Placas
Illumina
Características
 Atualmente o padrão-ouro para muitas das análises de NGS.
 Utiliza como base o sequenciamento por síntese (SBS).
 Três linhas de equipamentos: MiSeq, NextSeq e HiSeq.
 Leituras de 36 bp nas primeiras versões, e agora de 150x2 em HiSeq e 300x2 em
MiSeq.
 Vantagens: Metodologia extremamente versátil e barata, Grande variedade de
protocolos para sequenciamento e análise de dados, Padrão da indústria.
 Desvantagem: Problema em regiões com extremo de conteúdo GC (GC%).
 Utilização: Utilizadas em vários estudos com diferentes objetivos e em diferentes
organismos. Como exemplo temos o sequenciamento de DNA microbiano,
montagem de novo de genes expressos em Eucalyptus, sequenciamento do
genoma mitocondrial de baleias, moluscos e humanos, detecção de SNPs em
dados de sequenciamento, entre centenas de outros estudos.
Como funciona o método
Os fragmentos de DNA da amostra são ligados aos adaptadores em ambas às
extremidades, o que permite sua fixação à lâmina de sequenciamento por hibridização a um
dos oligonucleotídeos fixados no suporte. Após o passo de amplificação pela PCR em ponte,
uma superfície de sequenciamento (flowcell- placa de vidro) possui mais de 300 milhões de
aglomerados (clusters), onde cada aglomerado é composto por cerca de 1000 cópias clonais
de uma única molécula. As moléculas de DNA clonadas nos clusters são sequenciadas de
forma paralela utilizando uma abordagem de síntese de DNA que emprega nucleotídeos
especiais contendo terminador reversível e radical fluorescente com porção removível. A
incorporação desses nucleotídeos impede que novas bases sejam incorporadas até que o
terminador seja removido. A DNA polimerase utilizada também foi modificada para permitir a
incorporação destes nucleotídeos modificados. Os nucleotídeos são marcados com
fluorescência, sendo quatro cores diferentes para distinguir entre as diferentes bases. A
posição e a sequência molde de cada cluster são deduzidas pela leitura da cor identificada em
imagens de alta resolução obtidas a cada passo de adição dos nucleotídeos.
VÍDEO
https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
Ion Torrent
A reação de polimerização gera naturalmente um H3+ , ou seja, um próton, que altera o pH do meio.
Essa alteração do pH é detectada por um transistor e convertida em um sinal elétrico
Representação dos sinais detectados pelo sensor de um único poço
Características

 Custo relativamente baixo


 Sistema simples
 Obtenção de até 100M de bases de dados em 2 horas
 Utiliza um chip de silício que pode detectar os íons de hidrogênio
liberados quando uma nova base é acrescentada a um feixe de DNA
Como funciona o método

O Ion Torrent é um equipamento com um custo relativamente baixo e que utiliza


uma tecnologia de sequenciamento por semicondutor de íons. Através da detecção
da alteração do pH provocada pela liberação de íons hidrogênio (H+) durante a
polimerização do DNA, o sistema Ion Torrent é capaz de determinar a sequência da
molécula em estudo, transformando o sinal químico em sinal digital. A simplicidade
do sistema, que elimina a necessidade de utilização de nucleotídeos modificados, de
lasers, scanners e câmeras elimina inúmeras etapas propensas a erros e garante
uma alta acurácia ao sistema (99,5% no dado bruto). A tecnologia atual permite a
obtenção de até 100 M bases de dados em uma única corrida e consume não mais
de 2 horas no equipamento. O sistema garante ainda uma cobertura homogênea da
sequência em estudo, até mesmo em regiões difíceis de sequenciar, como regiões
ricas em conteúdo GC e regiões de homopolímeros.
VÍDEO
https://www.youtube.com/watch?v=WYBzbxIfuKs
Referências
- CARVALHO, M. C. C.G.; SILVA, D. C. G. Sequenciamento de DNA de nova geração e suas aplicações na
genômica de plantas. Disponível em:<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-
84782010000300040>. Acesso em: 25 Abril de 2018.

- GIUSTI, J.; KETTENER, K.; FERRAZ, M.C.P.F. Influência do sequenciamento de nova geração no futuro da
genética da conservação. Disponível
em:<http://www.recursosgeneticos.org/Recursos/Arquivos/15._Influ_ncia_do_sequenciamento_de_nova_gera_o
_no_futuro_da_gen_tica_da_conserva_o.pdf>. Acesso em: 25 Abril de 2018.

- PINTO, L.S.; KREMER, F.S. Capítulo 3. Plataformas de Sequenciamento de Nova Geração & Pré-
processamento de dados. Disponível em:<labbioinfo.ufpel.edu.br/aulas_2016/Capitulo%203.docx>. Acesso
em: 25 Abril de 2018.

- FERNANDES, C. C. Introdução às Tecnologias de Sequeciamento: Sanger e Nova Geração (NGS).


Disponível em:<http://genomics.fcav.unesp.br/Aulas2016/Aula3.pdf>. Acesso em: 25 Abril de 2018.