Profª. Drª.

Priscila Mello
✓ Reação que permite a amplificação
de um fragmento específico de DNA,
aumentando a possibilidade de
visualização.
Seqüência alvo

✓ “XEROX MOLECULAR”
 ✓ 1971 - Gobind Khorana:
replicação de um pedaço de
DNA 2 primers.

✓ 1952 - Watson & Crick:

 Modelo da molécula de DNA
✓Maquinaria de
Replicação.
✓ Separação da dupla fita de DNA

- Helicase X Aumento da temperatura

✓1985 - Kary B. Mullis- Amplificação
de sequências de DNA.
 Limitações:
-Síntese de primers

- Purificação de DNA polimerase

✓ Limitações:
- Síntese de primers
- Purificação de DNA polimerase
✓ 1976 - Thomas D. Brock
- DNA polimerase termoestável de
Thermus aquaticus .
 ✓ Elongação

✓ Desnaturação

✓ Anelamento
✓ Termociclador
✓ amostra de DNA (template- molde)
- DNA genômico
- cDNA
✓ primers (iniciadores)

✓ dNTPs

✓ DNA polimerase
DNA
✓ MgCl2

✓ Solução Tampão e água destilada

Esta reação permite a amplificação de qualquer
sequência de DNA coletada de amostras de materiais
biológicos como sangue, urina, outros fluidos corporais,
cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de
microorganismos, células vegetais ou animais mesmo
que com milhares de anos, também podem ser
detectadas pela PCR.
 VANTAGENS
* Aplicável em organismos mortos. Uma vez que a amplificação
ocorre in vitro, e depende apenas da amostra genética coletada,
não do complexo enzimático do organismo.
 DESVANTAGENS
* Facilidade de contaminação: Devido a sua alta sensibilidade,
os fragmentos de amostras anteriormente trabalhadas
(amplicons na forma de aerossóis) podem vir a serem
amplificados no processo.

Para reduzir o risco de contaminações são fundamentais os

seguintes cuidados:
 DESVANTAGENS
• A separação física em dois laboratórios “pré-PCR” e “pós-PCR”,
de modo que cada um tenha o máximo de independência
possível

• Descarte de ponteiras e tubos utilizados.

• Controle do fluxo de pessoas, também de visitantes externos,

mas principalmente do pessoal que pode transitar de um
laboratório para o outro. O maior risco de contaminação é
através dos amplicons (fragmentos de DNA) produzidos no
laboratório pós “PCR” e transportados pelos experimentadores
ate o laboratório de “pre-PCR”.
✓ Composta por ciclos

✓Desnaturação das cadeias

✓Anelamento dos Primers ou iniciadores

✓ Polimerização das novas cadeias complementares pela

ação da enzima Taq DNA polimerase.
✓ Temperatura de 94 a 96ºC (3 a 5 minutos )
✓ Temperatura de 94 a 96ºC (30 segundos)
✓ Temperatura varia de acordo com os primers

✓Tempo
✓ Temperatura de 72ºC, tempo varia de acordo com tamanho
do amplicon
 Desnaturação

Anelamento

Final do ciclo
Extensão

✓ Nº de ciclos variável: 25 a 30
 No. No. Amplicons
1 ciclo = 2 Amplicons Ciclos Copias do DNA alvo
2 ciclos = 4 Amplicons
1 2
3 ciclos = 8 Amplicons
2 4
4 ciclos = 16 Amplicons
3 8

5 ciclos = 32 Amplicons 4 16

5 32
6 ciclos = 64 Amplicons
6 64

20 1.048.576
7 ciclos = 128 Amplicons
30 1.073.741.824
✓ Eletroforese em gel de agarose
 Diagnósticos de doenças infecciosas:

 O diagnóstico de doenças infecciosas tem

como principio a detecção do patógêno ou de
sua ação..
Atualmente, o PCR é utilizado em laboratórios de
investigação médica e biológica objetivando diferentes
tarefas, como a identificação de doenças hereditárias, a
construção de árvores filogenéticas, a clonagem de genes,
teste de paternidade, detecção de organismos causadores
de infecções, concepção de organismos transgênicos, entre
outras.
✓ Diagnósticos moleculares

Identificação de doenças hereditárias

Testes de paternidade
✓ Teste de paternidade

-Baseado em seqüências repetitivas encontradas no DNA

-Microssatélites (SNP- single nucleotide polimorphism): classe

de DNA repetitivo de poucas bases

- STR ou VNTRs : regiões com número variável de repetições

✓ Microsatélites (SNPs)

✓ Marcador molecular de
doença
✓ Teste de paternidade
✓ Teste de paternidade

PM M F P1 P2
✓ Identificação de indivíduos
 Amostra
Acusado Vítima
✓ Análise Forense

DNA controle
✓ Análise da expressão de genes (RT-PCR)

- Extração de RNAm

- Preparo do cDNA

- gene de referência (gene constitutivo)

400bp

310bp

260bp

75bp
✓ RAPD