- Biotecnologia = Antiga, clássica, moderna.

Produção de bebidas alcoólicas, pães, vinagre, iogurte, etc.

- Renina: Utilizada para o queijo
- Antom leeuwenhock = descoberta microorganismos
Pasteur = provou que os microorganismos
- Buchner - Enzimas
- Fleming - Fungo Penicillium (penicilina)
- síntese de glicerol, acetona, ácido cítrico
- Processos fermentativos - Antibióticos
- Descoberta e manipulação do DNA
- Insulina
- PCR
- Vacina recombinante
- clonagem de animais
- Sequenciamento genoma bacteriano
- Sequenciamento genoma humano

- mendel - leis da hereditariedade

- Miescher - nucleina (DNA)
- Watson e Crick - Dupla hélice DNA
- Código genético é descoberto

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- DNA Recombinante
- manipulação de genes, clonar genes ou sequencias recombinantes >
veiculo/vetor = DNA recombinante
- inserido em hospedeiro = bactéria
- rompimento do DNA nas ligações açucar/fosfato por enzimas = endonucleases
de coesão
- refazer ligações = ligases
- clivagens cegas e clivagens coesivas
- Análise por gel de agarose.

- Vetores: Plasmídeos: Inserção de cromossomo, Replicação, obtenção de

produto gênico
- origem de replicação
- pequeno
- diferentes sítios para diferentes enzimas de restrição
- marcas de seleção
-células hospedeiras: bactérias
- Transformação: Choque térmico ou eletroporação
- fragilização da membrana da bactéria por diferença de temperatura
- cloreto de cálcio: tornar a superfície das bactérias + positivo
Técnica de clivagem para confirmar a clonagem: após a clonagem, podemos
cortar novamente o plasmídeo que recebeu o inserto, colocar no gel de agarose
e correr pra verificar o tamanho do plasmídeo e o tamanho do inserto. Podemos
usar as enzimas de restrição, cortar o incerto do plasmídeo e confirmar se o DNA
que entrou ali tinha o tamanho correto do nosso inserto de interesse.
Como você usaria PCR para confirmar a clonagem e qual primer usaria: Primers
para aquela sequência específica. O resultado do PCR pode ser analizado por
eletroforese e gel de agarose, confirmando o tamanho do fragmento.
- Marcador de b-galactosidase = Bactérias que ficam azuis, não possuem o
incerto desejado, pois estão produzindo a b-galactosidase.

> Bactérias são transformadas com o plasmídeo

> seleção das bactérias com antibiotico
> pré-inoculo da colônia selecionada
> crescimento em meio líquido em maior volume contendo indutor de expressão
> centrifugação, lise e purificação.

- IPTG = indutor
- identificação da proteína recombinante: cauda de histidina = usa anticorpo
contra histidinas

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- NGS: mais rápido, custo menor.

> Obtenção do DNA molde

- Tecido ou fonte
- Extração do DNA
>>> em caso de eucariotos extração do RNA e conversão a DNA por PCR
- Preparo da biblioteca - Adição de sequências terminadoras

> Amplificação do molde

- Intensificação do sinal.
- (454, Solid, GeneReader, Ion Torrent) microesferas - possuem primers que vão
se ligar as sequências terminadoras
> hibridização biblioteca + microesferas = adição nucleotídeos PCR
- (Illumina, Solid) Em superficie plana: fixação dos primers em superficie planas
(hibridização biblioteca + primers formando pontes)
- (Complete Genomics)Em Nanoballs: DNA enovelado em forma circular,
realizado amplificação com DNA polimerase, imobilizadas em uma flow-cell

> Sequenciamento
- Sequenciamento por ligação: Usa enzima DNA ligase
> (Solid) Em ligação: Sondas ligadas na fita molde (sonda é marcada em cor
específica) = Hibridização e detecção de sinais.
> (Complete Genomics) Em ligação: Sonda é ligada a uma base marcada de
cada vez + florescência.
- Sequenciamento por síntese: enzima DNA polimerase (PCR)
> (Illumina) Em síntese: Nucleotídeos marcados e bloqueados (não possibilitam
a continuação da síntese da fita molde). Ciclo de incorporação de nucleotídeos +
sinal + remoção do fluoroforo.
> (Gene Reader) Em sintese: Algumas bases estão marcadas com fluoroforo e
outras não. Ocorre a detecção de um tipo de base de cada vez.
> (454) Em sintese (sem fluorescência): Pirosequenciamento (enzima
sulforilase), adição dos nucleotídeos (um de cada vez). Quando o nucleotídeo é
incorporado ocorre a liberação do pirofosfato, ativando a enzima sulforilaze,
emitindo luz (sinal).
> (Thermo Fisher) Em síntese: Variação de pH. Adição de nucleotídeo (um de
cada vez) = Liberação de um Próton = Detecção do sinal.

- (Pacific Bio) Fragmentos longos (sem fluorescência): Sequência longa com dois
hairpins nas extremidades. Nucleotídeos que passem pelo meio da sequência
entre os Hairpins são incorporados, emitindo luz (sinal) em cores diferentes em
cada poro.
- (Oxford Nanopore) Fragmentos longos (sem fluorescência): Usa uma proteína,
que forma um poro. Utiliza uma sequência longa com Hairpin. A sequência passa
por dentro do poro, e não há incorporação de nucleotídeos. Ao passar pelo poro,
cada nucleotídeo emite uma carga (sinal), que é detectada pelo sistema.
- (Illumina, Genimics) Fragmentos longos (com fluorescência): Fragmenta o DNA
em pedaços. Pedaços são sequenciados individualmente utilizando de Bar Codes.

> Análise de dados

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Transcriptoma e RNA Seq

- Transcriptoma: Transcritos (RNAs) em uma célula e sua quantidade =

desenvolvimento específico/fisiológico.
> Interpretar elementos no genoma
> Revelar proteínas
> Compreende elementos desenvolvimento de doenças
> Conhecer padrões de Splicing (eucarióticas)
> Encontrar MicroRNAs = função reguladora
- RNA Seq: Análise do perfil de transcriptoma = Deep-sequencing

> Uma mesma região = sequenciar várias vezes = confiabilidade do resultado

> Análise de dados = leituras curtas pré-processadas = remover erros de
sequenciamento; Corrigidos erros; Montados transcritos;
> Abundância avaliada
> Geração de dados = extraído mRNA ou tRNA; removidos contaminantes e/ou
RNAs ribossomais; RNA é fragmentado e transcrito em cDNA; Ligados
adaptadores; Sequenciado.

- Dois tipos de bibliotecas:

> Genômica: Digestão parcial do DNA (endonucleases de restrição); Fragmentos
são clonados; = Mistura de vetores, cada um com um fragmento clonado
diferente; Mistura é usada para transformar bactérias e leveduras em uma
biblioteca de células.
> Biblioteca de CDNA: Incluem apenas sequencias de DNA expressas
(transcritas de um RNA - mRNAs); Prepara-se os DNAs complementares
(cDNAs); Dependente de transcriptase; DNAs de cadeia dupla formados são
inseridos em vetores e clonados = biblioteca de cDNA = Presença de um gene
específico nesta biblioteca = condições utilizadas apra produzir a biblioteca.
- Adaptadores na extremidade do RNA = Não perder direcionalidade
- Não trabalhar com RNA = não são moldes para PCR

- RNA mensageiro = molde = é anelado = transcriptase vai montar a fita de DNA

complementar = híbrido de DNA e mRNA (degradado) = DNA Polimerase I cria a
dupla fita.
- CDNAs são clonados em vetores
- Vetores contendo cDNAs sçao inseridos em bactérias para multiplicação
- Pode ser usado para molde de PCR ou sequenciado.

Diferenças:
- Genômica: Todo o DNA do genoma (transcritas e não transcritas)
- cDNA: Apenas o genoma transcrito.

> Plataformas utilizadas: Illumina, Solid e 454

- Montagem Transcriptoma:
> Estratégia de referência:
- Existe um genoma de referência e o transcriptoma pode ser construido a partir
dele. Programas: Blat, TopHat, GSNAP.
- Alinhamento das sequencias ao genoma; Gráficos representativos aos eventos
de Splicing; São montadas as variantes; Montadas as isoformas.
- Vantagens: Descarta artefatos e contaminantes.
- Desvantagens: Não é possivel sem um genoma de referência;
> Estratégia de novo:
- Se utiliza da redundância das leituras para encontrar sobreposições entre as
leituras. Gráfico De Brujin.
- São gerados Reads de tamano específico; São gerados gráficos De Brujin;
Gráficos De Brujin são colapsados; Feito um gráfico para analizar a montagem.
- Vantagens: Não depende de um genoma de referência;
- Desvantagens: Grande quantidade de dados.
> Estratégia combinada:
- Vantagem da sensibilidade do alinhamento e encontrar transcritos novos
trans-spliced
- Realizarr Alinhamento primeiro para descartar sequencias já conhecidas e
entçao realizar a montagem De Novo com uma quantidade muito menor de
dados.
- Quando o genoma de referência tem baixa qualidade = Fazer De Novo
primeiro.

Aplicações:
- Descoberta de pequenos RNAs; Fusão de genes em Câncer; Identificação de
mutações; Metagenômica.