Mini Curso – Produção de Proteínas Recombinantes e Biologia Sintética

Beatriz Cristina Pecoraro Sanches Priscila Alves Silva

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biapecorarosanches@gmail.com priasilva@gmail.com
Michele Fernanda Dutra
______________________
Michele.084@terra.com.br
Mini Curso – Produção de Proteínas Recombinantes e Biologia Sintética

O que é a Tecnologia do DNA recombinante?

Análises In silico, softwares de Biotecnologia
Extração de DNA
PCR, suas variações e aplicações
Clonagem Molecular
Expressão e obtenção de proteínas

Aplicações
Definição e Histórico
 O que é a Tecnologia do DNA recombinante?

A tecnologia do DNA recombinante compreende uma série de procedimentos para juntar fragmentos de DNA diferentes.

Isso só é possível pois o código genético é universal.

1928 1961 1962 1973 Atual

Frederick Grifth: Princípio Descobriu-se que o DNA Watson e Crick: Prêmio da Primeiro grande marco na CRISPR
da Molécula era o principal responsável descoberta do Modelo da tecnologia: construção do
Transformante pelo processo de síntese estrutura 3D do DNA. 1⁰ plasmídeo bacteriano
de proteínas. (A descoberta propriamente foi funcional.
78:Produção da Insulina
em 1953).
97: ovelha Dolly
03: Homo sapiens
Princípio da Célula Transformante 95: Transgenia
Tecnologia do DNA
recombinante
O que é a Tecnologia do DNA recombinante?
 Como funciona a Tecnologia do DNA recombinante?

Enzimas de Restrição (endonucleases – clivam o DNA): serve para a bactéria se defender e proteger o DNA
bacteriano de um DNA exógeno. Apesar dessas enzimas serem detectadas em algumas bactérias, hoje em dia
elas são utilizadas para cortar o DNA em regiões específicas.

Cortam sítios palindrômicos: cortam a mesma sequência de trás pra frente

Corte Coesivo Corte cego

 Como funciona a Tecnologia do DNA recombinante?

Plasmídeos

Encontrado em bactérias e leveduras.

É um DNA pequeno e serve para a bactéria resistir à ação de algum antibiótico.

Para ser usado na tecnologia: o plasmídeo é retirado da bactéria, cortado in silico em um ponto específico com a utilização da
enzimas de restrição. Depois, a esse plasmídeo ou tenho que acrescentar o gene (exógeno) que eu quero inserir e depois,
realmente inserir isso na bactéria
 Como funciona a Tecnologia do DNA recombinante?

Tipos variados de Plasmídeos

Fago Lambda Cosmídeos BAC`s

Usado para produzir um genoma

completo, por exemplo
Diferenças:
genes par (uma cópia para cada
célula filha)
Ori de baixa cópia
Não vou ter uma grande quantidade
de plasmídeo bac por bactéria

YAC`s

Usado para realizar

transformação em leveduras
(pois leveduras também
apresentam um plasmídeo)
 Como funciona a Tecnologia do DNA recombinante?

Plasmídeos de “Entrada” Plasmídeos de

(Clonagem) Expressão
 Como funciona a Tecnologia do DNA recombinante?

Vetores/hospedeiros de clonagem

Uma célula hospedeira ideal deve ser fácil de manipular e propagar, deve estar disponível , com uma grande quantidade de
cadeias geneticamente definidas. A bactéria Escherichia coli preenche estes requisitos, e é usada em muitos protocolos de
clonagem.

Arabidopsis Saccharomyces Escherichia coli

Drosophila cerevisiaec
thaliana melanogaster
 Como funciona a Tecnologia do DNA recombinante?

DNA Ligases

A DNA ligase cataliza a formação da ponte fosfodiéster entre a extremidade 5' fosfato e a 3' hidroxila formando o
duplex de DNA ou RNA.
Ela usa ATP, DTT e Mg2+ para esta função.

Imagem: https://www.youtube.com/watch?v=xMBC3q_CbTA
Extração de DNA
 Por quê fazer a extração de DNA?

Usada para análise funcional e para detecção

Extração de Humanos

Extração Extração Extração de Extração de

Vegetal Animal Fungos Bactérias
Fases da Extração de DNA Tipos de Extração de DNA

Lise Mecânica

Precipitação Enzimática

Purificação Química
 Procedimentos de Extração

Passos gerais das extrações: lise, precipitação, purificação e eluição do DNA

Principais tipos de Extrações de DNA
Kits comerciais (usado para sequenciamento de DNA para ter qualidade melhor de DNA);
Laboratoriais (usa-se de soluções salinas, reagentes químicos);
Quelex: (quelante de troca iônica – o DNA fica absorvido em uma parte e o restante é eluido).
Extração magnética: adição de partículas magnéticas à resina que se liga ao DNA em solução, e
posteriormente, os complexos DNA-partículas magnéticas são capturados por um imã.
 Procedimentos de Extração
Passos Gerais da extração vegetal:
1) Romper a membrana plasmática das células; (lise celular)
2) Precipitação do DNA – Adicionando isopropanol (coletar a fase aquosa)
3) Centrifugação (neste passo o DNA está no precipitado)
4) Purificação com etanol 95% (para retirar restos isopropanol e restos de contaminantes).
5) Centrifugação
6) Adição de etanol 70% (para retirar o álcool 95%).
7) Centrifugação, evaporação e hidratação
Tipos e Variações das
Extrações
Quantificação e qualidade
do DNA
 Quantidade Pureza Integridade

Fluorimetria Espectrometria Eletroforese

Medição da fluorescência de Tende a ter uma banda só,

um fluoróforo adicionado à Razão A260/280
amostra alvo Razão A260/230 consistente, sem arrastes

** Para ter valores numéricos eu

posso usar a eletroforese capilar
 Cuidados com os processos
de controle de qualidade

O nanodrop e o QuBit são equipamentos que merecem atenção:

Cuidado com a cubeta,

Cuidado com bolhas
Cuidado com amostras muito concentradas.
Reação de PCR
Duplicação do DNA
 Reagentes da PCR
As propriedades químicas da água no estado líquido permitem que substâncias polares ou
iônicas formem soluções aquosas. Em procedimentos tão sensíveis quanto a PCR, deve-
se sempre utilizar a água ultrapura.

O “alvo” ou template é aquele que será amplificado durante a PCR. Ele pode ser de
diversas naturezas: fita simples ou dupla, genômico, plasmidial, viral ou celular.

Os dNTP`s são a matéria-prima da síntese do DNA durante a PCR. Em essência, há

quatro tipos de dNTP: adenina, guanina, citosina, timina.

A enzima mais comumente usada na PCR é a Taq DNA polimerase, estável ao

calor e altas temperaturas.

Importante cofator da reação, estimulando a

atividade da Taq

Fornecem as extremidades 3’ OH livres necessárias para que a DNA polimerase inicie o

processo de replicação do DNA molde. Além disso, são os primers que determinam a
sequência do DNA que será amplificada. Eles se ligam ao DNA molde na etapa de
anelamento por pareamento de bases.
Reação da Polimerase em Cadeia
Reagentes da RT-PCR

As propriedades químicas da água no estado líquido permitem que substâncias polares ou

iônicas formem soluções aquosas. Em procedimentos tão sensíveis quanto a PCR, deve-
se sempre utilizar a água ultrapura.

O “alvo” ou template é aquele que será amplificado durante a RT – PCR.Pode ser usada
para detecção de vírus.

Os dNTP`s são a matéria-prima da síntese do DNA durante a PCR. Em essência, há

quatro tipos de dNTP: adenina, guanina, citosina, timina.

A enzima mais comumente usada na PCR é a Transcriptase Reversa.

Importante cofator da reação, estimulando a

atividade da RT

Os primers se mantém como DNA de fita simples..

 RT-PCR

Imagem disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=h2peadwu1zk&t=4830s

 RT-PCR

Imagem disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=h2peadwu1zk&t=4830s

qPCR
 qPCR

O nível de fluorescência aumenta de maneira proporcional ao aumento do número de

cópias amplificadas

Imagem disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=h2peadwu1zk&t=4830s

 Desenho de Primers

São sequências complementares ao início e ao final da minha sequência de interesse

São oligonucleotídeos necessários para a iniciação da replicação

Tamanho

Quantidade G/C

Repetições

Tamanho do produto (template) .

Região do alvo:
 Banco de dados e Softwares de
Biotecnologia

Ms. Michele Fernanda Souza Dutra

 Banco de dados
Análise da expressão dos genes: grande importância e interesse
para a área de ciências biológicas Funções de uma célula
Década de 70: "bioinformática“ - o estudo dos processos
computacionais nos sistemas bióticos''

A pesquisa de similaridade em bancos de dados de sequência de DNA e

proteínas é um campo essencial na pesquisa genômica

O método fundamental para encontrar as funções de DNA e sequências de

proteína é medir as semelhanças entre duas sequências
 Banco de dados
O que são banco de dados biológicos?

Coleções/ bibliotecas de dados biológicos

Função

Organizar e estruturar as informações de modo a

facilitar consultas, atualizações pelos
pesquisadores
· Sequências (de nucleotídeos ou de proteínas) e anotações sobre as mesmas,
· Proteínas e informações sobre as respectivas funções,
· Estruturas de moléculas de proteínas (secundárias, representadas em um
plano, ou terciárias, representadas em três dimensões),
· Taxonomia (classificações dos organismos vivos),
· Bibliografia na área de biologia molecular (artigos, jornais, periódicos, etc).
 Banco de dados
Principais bancos de dados primários – sequencias de nucleotídeos

• GenBank (National Center for Biotechnology Information – NCBI) INSD (International

• EMBL (European Bioinformatics Institute) Nucleotide Sequence
• DDBJ (DNA Data Bank of Japan – National Institute of Genetics) Database)

>5.700 organismos

Banco de dados – interatividade e

mesma linguagem (padronização)
 Banco de dados de nucleotídeos

GenBank (NCBI)

• Achar genes homólogos

• Referencias bibliográficas
sobre o gene
• Estrutura da proteína que
codifica para este gene
 Banco de dados de nucleotídeos

GenBank (NCBI)
Banco de dados de nucleotídeos
FASTA Genbank
Banco de dados de nucleotídeos
Detalhes gene/CDS
FASTA Genbank
Banco de dados de nucleotídeos
Blast
 Banco de dados de proteínas
Principais bancos de dados de proteínas – aminoácidos e estruturas

• Expasy (Expert Protein Analysis System) e UNIPROT - Swiss Prot Protein Sequence
Data Bank
• InterPro
• PIR (Protein Identification Resource) - International Protein Sequence Database
• PDB (Protein Data Bank)
 Banco de dados de proteínas

Uniprot e InterPro

• Achar proteínas
homólogas
• Referencias
bibliográficas
• Estrutura e anotação
das proteínas
• Localização subcelular

• Achar proteínas
homólogas
• famílias de proteínas
• Domínios proteicos
 Banco de dados de proteínas

Expasy

• Achar proteínas
homólogas
• Estruturas de
proteínas; modelagem
• Design de drogas
• Promotores de
eucariotos
Banco de dados de proteínas

Expasy
 Banco de dados de proteínas

Expasy

UniProt

OrtoDB
Banco de dados de proteínas

Expasy

STRING
 Softwares de predição

Algoritmos para predizer funções, estrutura,

hélices transmembrana, peptídeo sinal, etc,
de proteínas

• HHMER - biosequence analysis using profile hidden

Markov models
Modelo oculto de Markov
• SignalP (Signal Peptide)
• TMHMM (Prediction of transmembrane helices in
proteins)
• PROTEIN TERTIARY STRUCTURE
Softwares de predição

TMHMM
 Softwares de predição

SignalP
 Softwares de predição

HHMER
 Softwares de predição
PROTEIN TERTIARY
STRUCTURE
 Softwares de predição

PYRE2
Banco de dados e Softwares de
Biotecnologia
 Clonagem Molecular

Ms. Michele Fernanda Souza Dutra

O que é clonagem molecular?
• Clone vem do Grego antigo klōn e quer dizer “galho” (totipotência). É
uma cópia genética de uma molécula, planta ou animal.

• Processo no qual são obtidas cópias de um determinado gene ou

sequência de DNA de qualquer organismo através de ferramentas de
biologia molecular. Ocorre pelo isolamento do gene e introdução em
vetores para replicação.
 O que é clonagem molecular?
• O método mais convencional de inserção de genes em vetores inclui
endonucleases (enzimas) de restrição e DNA ligase, que catalisa as
ligações fosfodiéster que existem estre os nucleotídeos que compõem
o DNA. Primers (oligonucleotídeos)

Extração
Clonagem de DNA Amplificação de
uma sequencia DNA/ Restrição com
endonuceases
Molecular gene determinados

Ligação da
Transformação
sequência de DNA/
genética
gene ao vetor
 O que é clonagem molecular?
Clonagem por restrição - 4 passos principais:

• Fragmentação do DNA por endonucleases de restrição

• Ligação dos fragmentos ao vetor

• Transformação genética

• Seleção/ Screening dos clones

 Endonucleases (enzimas) de restrição
• Enzimas descobertas em bactérias cuja função é reconhecer e clivar
sequencias específicas de nucleotídeos (DNA).

GAATTC
5’ 3’ CTTAAG
host-controlled
variation
 Endonucleases (enzimas) de restrição

• ERs do tipo II:

reconhecimento
palindrômico e dois tipos de
cortes: blunt ends (abrupto)
e sticky ends (coesivo)
Endonucleases (enzimas) de restrição
• Importante: Verificar o número de sítios de clivagem no vetor de
destino (MSC) e na sequência de interesse!

SnapGene®
DNA ligase – Ligação do fragmento

Ligação

DNA ligase
 Vetores de clonagem
• DNAs geralmente circulares que possuem de 2 kb ate 1 Mb e se
multiplicam dentro da célula hospedeira

• Tipos de vetores utilizados em clonagens:

• Plasmídeos Até 10 kb
• Bacteriófagos (fagos) Até 20 kb
• Cosmídeos Até 40 kb
• BACs Até 300 kb
• YACs (no caso de leveduras) Até 1 Mb
Vetores de clonagem
Plasmídeos
• DNAs circulares bacterianos extra cromossomais
• Plasmídeo de entrada/ clonagem Resistência a ATB, metais
• Plasmídeo expressão e radiação
• Plasmídeo binário
Fixação de N2

Determinantes de virulência
Vetores de clonagem
Plasmídeos – Entrada/clonagem
Vetores de clonagem
Plasmídeos – Expressão

T7 promoter: dirige a expressão do

gene de interesse;
T7 terminator: finaliza a
transcrição/ tradução do gene de
interesse
Vetores de clonagem
Plasmídeos – Binário
Agrobacterium
tumefasciens
Vetores de clonagem
Plasmídeos – sistemas de clonagem

TA cloning

GC cloning
Vetores de clonagem
Plasmídeos – sistemas de clonagem

Gateway cloning

DNA ligase
 Vetores de clonagem
Plasmídeos – sistemas de clonagem

Golden Gate cloning

Clonagem dirigida e não dirigida

Vídeo Snap Gene

 Competência bacteriana e transformação genética
Competência bacteriana

Capacidade natural de algumas bactérias

em captar DNA exógeno do ambiente
por um processo chamado de
transformação.

Processo natural raro

Competência
artificialmente
 Competência bacteriana e transformação genética
Transformação genética
Choque térmico Choque elétrico

Gelo 30’ cuveta

Banho-maria
a 42 °C

eletroporador
Competência bacteriana e transformação genética
Operon Lac e seleção de transformantes
Operon Lac e seleção de transformantes

Galactose

Lactose
Operon Lac e seleção de transformantes

Blue/White screening
pGEM T Easy
 Operon Lac e seleção de transformantes
Blue/White screening
Antibiótico

IPTG + X-Gal + Antibiótico

LacZa inserto

IPTG + X-Gal + Antibiótico

Antibiótico

IPTG + X-Gal + Antibiótico

5-bromo-4-chloro-indoxy
isopropil-β-Dtiogalactopiranosídeo
 Vetor suicida e seleção de transformantes
Vetor suicida
Antibiótico
IPTG + Antibiótico

Gene suicida inserto IPTG + Antibiótico

Antibiótico IPTG + Antibiótico

 Expressão e obtenção de proteínas
recombinantes em bactérias

Ms. Michele Fernanda Souza Dutra

 Indução da expressão bacteriana
O que é expressão?

Dogma Central

O Dogma Central é o
mecanismo que rege a forma
como o DNA é transformado
em proteínas. GATC GAUC
Indução da expressão bacteriana

Dogma Central - Transcrição

Indução da expressão bacteriana
Dogma Central - Tradução
Códons degenerados
Indução da expressão bacteriana
Como ocorre a expressão
em plasmídeos?
 Indução da expressão bacteriana
Sistema de expressão pET28a
 Indução da expressão bacteriana

IPTG

Crescimento por ~5h à 37 °C

Crescimento por 15h à <25 °C

OD600 = 0,6 – 0,8

Meio de cultura (Luria Bertani + antibiótico)

 Extração proteica
Lisado clarificado
Cultura induzida Tampão de lise Sonicador (fração solúvel) e
pellet (insolúvel)
Centrifuga Centrifuga

Quantificação
e SDS-PAGE Purificação
 Purificação proteica – Cromatografia de afinidade
Cromatografia De Afinidade Por Íons Metálicos Imobilizados (IMAC):
princípio fundamental da afinidade de grupamentos de biomoléculas por
íons metálicos imobilizados Cu , Ni , Co e Zn
2+ 2+ 2+ 2+

Íon metálico quelatado em sólido

Imidazol

His6 tag
Purificação proteica – Cromatografia de afinidade

Imidazol

Coluna

Resina
Ni-NTA
 Quantificação de Proteínas - Bradford
Princípio de Bradford: formação de um complexo entre o corante
azul brilhante de Coomassie G-250 e as proteínas da amostra.
Reagente de
deslocamento do equilíbrio do corante da Bradford
forma aniônica (vermelha) para a forma
catiônica (azul),
Quantificação de Proteínas - Bradford
 SDS –PAGE
SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)

• Sódio-Dodecil Sulfato: Detergente que

solubiliza e adsorve proteínas
Empacotamento
• Poliacrilamida: matrix de acrilamida e bis-
Separação
acrilamida (polímero)

Desnaturação proteica
Tris-Glicina
+ SDS

Separação com base no PM Poliacrilamida + SDS

 SDS –PAGE

• Caracterizar
• Quantificar
• Determinar a pureza da amostra
• Comparar proteínas de diferentes fontes
• O primeiro passo na técnica de Western-blot

Quantidade

Pureza
 Western-blot
Imuno-detecção de proteínas após sua separação por eletroforese
e transferência para uma membrana
Transferência para membrana

Esponja
Bloqueio
Papel filtro

Gel SDS-PAGE Membrana possui alta

afinidade por proteínas

Membrana
Papel filtro Bloqueio com
Esponja caseína
Western-blot

Detecção da reação
Adição de anticorpos específicos

Anti-Mouse

Anti-His6
Cell-free protein expression
Tradução in-vitro
mRNA
Cell-free protein expression
Alternativa à:

- Formação de corpos de inclusão (Fração insolúvel);

- Proteínas tóxicas;
- Proteínas que são rapidamente degradadas por
proteases intracelulares;
- Proteínas de membrana;
- Proteínas virais
 Bioética
Termo “Bioética” surgiu em 1971; Com o avanço das pesquisas
científicas e dos artefatos tecnológicos surgiu a importância de
discutir essa produção, os seus impactos na sociedade e os limites e
alcances desse tipo de conhecimento.
pluralismo de ideias que se referiam às questões morais.

1996 foi editada a Resolução 196/96, que estipulou

pesquisas científicas com seres humanos, o sistema CEP/ CONEP, composto pela Comissão
Nacional de Ética em Pesquisa - CONEP/CNS/ MS,
do Conselho Nacional de Saúde
comitês éticos
Bioética
comitês éticos

estabelecer um diálogo com os pesquisadores proponentes de

pesquisas científicas com o intuito de promover reflexões

Princípios:

Autonomia
Beneficência
Não-maleficência
Justiça
 CTNBio – Comissão técnica
Especialista Área de Saúde Humana

Especialista Área de Saúde Animal

Especialista Área Vegetal ~19 especialidades

A CTNBio é uma instância colegiada multidisciplinar, cuja finalidade é prestar

apoio técnico consultivo e assessoramento ao Governo Federal na formulação,
atualização e implementação da Política Nacional de Biossegurança relativa a
OGM, bem como no estabelecimento de normas técnicas de segurança e
pareceres técnicos referentes à proteção da saúde humana, dos organismos
vivos e do meio ambiente, para atividades que envolvam a construção,
experimentação, cultivo, manipulação, transporte, comercialização, consumo,
armazenamento, liberação e descarte de OGM e derivados. (Site CTNBio)
Especialista em Biotecnologia Especialista Área de Meio Ambiente
 Biossegurança

Cuidados essenciais para o desenvolvimento de atividades em

diferentes ambientes de trabalho.

ações voltadas para a prevenção,

minimização ou eliminação dos riscos
inerentes às atividades de pesquisa

Vestimentas

Equipamentos de proteção

Descartes de materiais (lixo biológico/ contaminante

etc)
Aplicação prática da Tecnologia do DNA Recombinante:
Produção de Transgênicos
 Transformação Genética em Plantas

Agrobacterium tumefaciens Biobalística

Bactéria do solo Partículas de ouro

Método Indireto

Método Direto
que tem ou tungstênio
capacidade de cobertas com DNA
transferir parte do perfuram a parede
seu DNA para celular e penetram a
dentro da célula da célula
planta

Produzido por Mateus de Almeida Santos, 2019

Biobalística
Agrobacterium tumefaciens

Produzido por Mateus de Almeida Santos, 2019

Agrobacterium tumefaciens
 Transformação Genética em Plantas

Agrobacterium tumefaciens

Substituição do T-DNA original pelo gene de interesse

Produzido por Mateus de Almeida Santos, 2019

 Princípios da Cultura de Tecidos Vegetais

Totipotência: propriedade das células reproduzirem uma planta inteira.

Desdiferenciação (Estado indiferenciado): processo de diversificação das características

bioquímicas, anatômicas, morfológicas e fisiológicas ocorrida nas células, nos tecidos ou órgãos da
planta durante o desenvolvimento, a partir do estado meristemático ou juvenil para o adulto. As
células do embrião e do meristema apical servem de exemplo do estado indiferenciado.

Re-diferenciação: retorno de células diferenciadas ao estado não meristemático.

As células embrionárias (meristemas) dos vegetais permite que elas

cresçam pelo resto de suas vidas
 Cultura de Tecidos Vegetais

Lavagem e desinfestação dos tecidos vegetais (explantes),

Organogênese indireta: Proliferação e crescimento de calos (massa de células com grau
desordenado de crescimento que pode apresentar certo grau de diferenciação).
 Princípais aplicações da Cultura de Tecidos Vegetais

Multiplicação de espécies de difícil propagação,

Obtenção de mudas limpas,

Utilizadas para Transfomação de Material Genético

 OGM’s X Transgênicos

Definições

O que é um organismo geneticamente modificado?

O que é um transgênico?

O que é um cisgênico?

Categorias de Transgênicos Biofarming

Produzido por Mateus de Almeida Santos, 2019
Referências Bibliográficas

BROWN, T. A. Genética: um enfoque molecular. 3ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1999. 336p.

Canal do Youtube: Universo da Biologia Molecular. Disponível em:

https://www.youtube.com/watch?v=h2peadwu1zk&t=4830s. Acesso em Nov. 2020.

Canal do Youtube: New England Biolabs. Disponível em: https://www.youtube.com/watch?v=xMBC3q_CbTA.

Acesso em Nov. 2020.

GRIFFITHS, A. J. F.; MILLER, J. H.; SUZUKI, D. T.; LEWONTIN, R. C.; GELBART, W. M. An introduction to genetic
analysis. 7. ed. New York: W.H. Freeman and Company, 2002. 860 p.

LEHNINGER, T. M., NELSON, D. L. & COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 6ª Edição, 2014. Ed. Artmed.

PEREIRA, T. C.. Introdução às técnicas de PCR convencional, em tempo real e digital. [S.l: s.n.], 2018.

S.; BUSO, J. A. (Ed.). Afiliação: ANTÔNIO CARLOS TORRES; L. S. CALDAS; J. A. BUSO. Título: Cultura de tecidos
e transformação genética de plantas.