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Biotecnologia de Algas

Manipulação Genética de
Microalgas

Por: Mestre, Mariamo J. M. Parruque - 2023

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Objectivos

Metodologias de manipulação de:

- Cianobactérias (procariótas)
- Microalgas eucariótas
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Biotecnologia

 Qualquer tecnologia que utiliza sistemas biológicos,

organísmos vivos, ou seus derivados,
 Para produzir/fabricar ou modificar produtos ou processos
para utilização específica
 Porque MooAlgas 4
 São responsáveis por um sequestro de
CO2 mais eficaz - Fotossintese

 Permitem a produção de várias

moléculas (proteínas, insecticidas,
vacinas, ácidos gordos , carotenóides,
polissacáridos, vitaminas, esteróis,
antioxidantes)

 Rápido crescimento (são unicelulares)

 Têm um ciclo de vida muito curto

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Porque manipulação genética?

 Melhorar as características de crescimento – floculação e

sedimentação;

 Possibilidade de crescimento em meio solido – vivem na água;

 Utilizar substratos de crescimento mais baratos;

 Possibilidade de crescimento e Produção de metabolitos

secundários em bio-reactores;

 Possibilidades de sintetizar proteínas terapêuticas recombinantes

 Manipular vias metabólicas para aumentar os níveis produção

de metabolitos desejáveis
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Duas técnicas de manipulação genética

1. Mutagenese e selecção

2. Tecnologias de DNA
recombinante
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Manipulação Genética de
Microalgas

1. Mutagenese
e
Selecção
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Mutagenese
 Processo através do qual a informação genética
de um organísmo e alterada de modo estável
resultando numa mutação;

 Resulta em m.pontuais, inserções e delecções,

duplicações;

 Ela pode ocorrer de forma espontanêa na

natureza ou de forma artificial por exposição a
agentes mutagénicos
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Mutagenese - desvantagens

1. Dependência nas qualidades

naturais das algas;

2. Dificuldade de produzir
recombinantes genéticos
estáveis – versos transientes
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Tecnologias do DNA
Recombinante
(Introdução de genes novos)
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Organismo Modelo
Chlamydomonas reinharditii
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Característica de C. reinhardtii

 Alga verde unicelular

 Filo Chlorophyta

 Cresce rapidamente em culturas

axênicas, meio sólido e líquido

 Possui habilidade de crescer tanto em

condições fotossintéticas assim como
heterotróficas
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Característica de C. reinhardtii

 Possui habilidade de crescer tanto como haploide assim como

diploide (como as leveduras)

 Permite a trasnformação do genoma nuclear assim como do

genoma dos cloroplastos e das mitocóndrias

 É facilmente selecionado através do uso de marcadores

auxotróficos

 É útil para análises de alelos recessivos

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Genoma de C. reinhardtii

 Possui um genoma nuclear que compreende 17 cromossomas

com um tamanho total de ~ 120 Mb.
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3 Genomas de C. reinhardtii
Nuclear, Cloroplastos, mitocondrias
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Chlamydomonas reinharditii

Organísmo modelo
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Crítico!!!

Apesar do enorme potencial, as técnicas moleculares

são subdesenvolvidas em microalgas em comparação
com plantas, fungos e bactérias superiores

 Avanços no sequenciamento de genoma,

 E nas tecnologias de edição de genoma

Fornecem impulso para aprimorar a pesquisa e

desenvolvimento da área
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Potencial das M. algas - investimento

 O Programa de Espécies Aquáticas (ASP)

 Nos EUA O Departamento de Energia (DOE)

financiou o Programa para desenvolver
combustíveis de transporte renováveis, a partir
de algas cultivadas em lagoas abertas
 Linha do tempo e marcos na 19
pesquisa de microalgas
Principais inovações na pesquisa de algas
Linha do tempo e marcos na 20
pesquisa de microalgas
Aplicações da biotecnologia
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O sistema CRISPR-Cas

 É uma tecnologia de edição de genes que permite fazer

alterações precisas e específicas no DNA de um organismo.

 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic

Repeats) é uma série de sequências repetitivas de DNA
encontradas em muitas bactérias e arqueias;

 Cas (CRISPR-associated proteins) refere-se às proteínas que

trabalham em conjunto com o CRISPR para cortar e editar o
DNA.
  Foi descoberto como um mecanismo de
defesa bacteriano contra vírus invasores -
Streptococcus pyogenes

 Foi adaptado para uso em biologia

molecular;

O sistema
 A técnica envolve a introdução da enzima
CRISPR-Cas Cas (geralmente a Cas9) e um guia RNA
que se liga ao DNA alvo específico que se
deseja modificar;

 A enzima Cas9 corta o DNA nesse local

específico, permitindo a adição, remoção ou
alteração do DNA como desejado.

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Principais tipos de sistemas CRISPR-Cas:
Tipo I:
Apresenta uma proteína
efetora do tipo Cas3 e um
complexo de proteínas
auxiliares que incluem
proteínas Cas5, Cas6 e Cas7.
Tipo III:
Apresenta uma proteína de
uma proteína efetora do tipo
Cas10 e um complexo de
proteínas auxiliares que
incluem proteínas Cas5, Cas6 e
Cas7.
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Tipo II:
Apresenta uma proteína
proteína efetora do tipo Cas9
e uma única proteína auxiliar
chamada de RNA guia
(sgRNA).
Tipo IV:
Apresenta uma proteína de
efetora do tipo Cas12 e um
RNA guia (crRNA) que é
processado em múltiplos
fragmentos curtos pelo
complexo de proteínas
auxiliares.
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Etapas do processo de aplicação do
sistema CRISPR-Cas nas microalgas
 1. Seleção do sistema CRISPR-Cas a ser usado

 2. Design dos guias RNA: que irão guiar a enzima Cas para o local
específico do DNA a ser editado, são complementares ao DNA alvo
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3. Entrega do sistema CRISPR-

Etapas do Cas:
processo de
aplicação
do sistema
CRISPR-
Cas nas ex: métodos de
transformação,
microalgas: eletroporação,
bombardeamento de
partículas, etc.
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3. Sistema de transferência de genes
em microalgas
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Etapas do processo de aplicação do
sistema CRISPR-Cas nas microalgas:

 4. Seleção e
Cultivo de células
editadas

 5. Verificação da
edição genética:
ex: por
sequenciamento
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Diagrama esquemático de todo o processo
técnico de
manipulação de genes de algas
Os mutantes isolados 29
pertencem a 8 categorias
principais:

- Mutantes resistentes
- Mutantes auxotróficos
- Mutantes sensíveis à temperatura
- Mutantes sensíveis à luz UV
- Mutantes sensiveis a radiação (raio x)
- Mutantes deficientes para o processo fotossintético
(pigmentos) e de fixação do nitrogénio ou metabolismo
do carbono
- Mutantes morfológicos
- Mutantes condicionais

Dada a facilidade de isolamento, os mutantes resistentes

constituem a classe mais numerosa dentro das
cianobactérias: a drogas, toxinas, luz UV, cianofagos, etc.
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Particularidades das microalgas – origens de
replicação

 Os Vectores devem possuir origens de replicação

reconhecíveis pelos hospedeiros a serem utilizados
na clonagem, na recepção ou na expressão do
gene de interesse.

 Os Vectores devem ser híbridos:

cianobatéria+ cianobactéria
cianobatéria + E. coli (pBR322)
cianobactéria+cosmidios
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Particularidades das microalgas –
marcadores de seleção

 É necessário adicionar marcadores genéticos de

seleção aos plasmídios das cianobactérias

 Genes de resistência a antibióticos – gene ble de

resistência a Zeamicina e fleomicina – é usado para
selecionar clones transgénicos em várias espécies de
algas

 Genes de resistência a herbicidas – amigos do

ambiente

 Várias enzimas metabólicas - amigos do ambiente

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Particularidades das microalgas –
Promotores

Os promotores Vectores de expressão - permitirem

altas taxas de transcrição dos genes clonados –

Devem ser Sequências regulatórias dos genes para

a produção de pigmentos fotossintéticos e de
ficobiliproteinas (promotores fortes)
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Particularidades das microalgas –
Indutores

 Luz – Proteína Induzida pela Luz (LIP) – 400pb

 Iões de nitrato e amónia

 Gene da metionina sintase (METE) - repressor

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Trasformação do Genoma
Nuclear
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Vantagens da transformação do
genoma nuclear

 Pode se induzir no núcleo a expressão de proteínas que são

excretadas nos cloroplastos ou mitocôndrias

 Permite efectuar modificações trasnlacionais nas proteínas

produzidas

 Permite a excreção de proteínas de interesse

 É importante na produção industrial de proteínas

recombinantes

 E na obtenção expressão estável

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Transformação do genoma dos
cloroplastos

 A primeira transformação estável ocorreu no genoma

dos cloroplastos de C. reinhardtii

 Principal vantagem – o transgene pode ser

directamente inserido por recombinação homóloga

 No genoma nuclear a integração pode ser aleatória –

requere processos intensivos de rastreio
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 Apesar do núcleo ser o alvo

preferencial para a expressão de
transgenes,

A modificação do genoma dos

cloroplastos apresenta muitas
vantagens:
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Vantagens da transformação do
genoma dos cloroplastos

 Maiores níveis de expressão de metabólitos de

interesse (há vários cloroplastos)

 Possibilidade de introdução de genes agrupados

em operões (muitos genes podem ser expressos
num único RNAm policistrónico)

 Introdução precisa do transgene no genoma por

recombinação homóloga
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Exemplos de produtos da biotecnologia de algas
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Barreiras técnicas a ultrapassar

 Embora as microalgas se
apresentem como alternativa
promissora

 Váriasbarreiras técnicas devem ser

ultrapassadas para que seu uso seja
economicamente viável:
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Barreiras técnicas a ultrapassar

Produção da biomassa em larga escala em sistemas

exteriores;
 Eliminação de espécies invasivas nos tanques de
cultura;
 Optimização dos métodos de extracção de baixo
consumo de energia
 de métodos de recolha de baixo consumo de
energia;
 Baixa penetrância luminosa em culturas de elevada
densidade
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Prespectivas
 A possibilidade de utilizar micro-algas
transgénicas na bioremediação;

 Como biosensores de poluentes (metais

pesados);

 a utilização de micro-algas na mitigação do

efeito de estufa, em sistemas de lagoas
abertas.