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As técnicas de rDNA permitem estudar diversos processos biológicos e obter benefícios em diversas áreas. Este consiste
na alteração do material genético fora do organismo para se obter características aprimoradas e desejadas aos
organismos vivos e outros produtos, o mesmo só é possível porque a estrutura química do DNA é partilhada por todos os
organismos diferindo, somente, na ordem dos nucleótidos. Além disso, sequências de DNA que não ocorrem de forma
natural podem ser criadas por síntese química do DNA.
Clivagem do DNA
Clivagem do DNA em locais específicos através de enzimas de restrição, o que permite o isolamento a manipulação de
genes individuais.
o Enzimas de restrição
▪ As enzimas de restrição são endonucleases que reconhecem sequências específicas de 4 a 12
pares de bases e que cortam o DNA originando 3 tipos de extremidades: extremidades cegas ou
abruptas, ou seja, nenhuma das cadeias fica protuberante levando a problemas na recombinação
sendo um dos tipos de corte menos eficiente; ou extremidades coesivas no 3´ ou 5´, as quais
emparelham muito mais facilmente, pois criam pontas em cadeia simples com sequências que se
complementam.
▪ Tipos de enzimas de restrição:
• Tipo I: dependem de ATP, 𝑀𝑔2+ , reconhecem uma sequência particular e cortam num
ponto não específico dessa sequência;
• Tipo II: dependem de 𝑀𝑔2+ , cortam de forma específica uma sequência particular de
DNA;
• Isosquisómeros: estas são enzimas de restrição diferentes pois provem de espécies de
estirpes diferentes das anteriores e reconhecem e cortam a mesma sequência de DNA
sendo perfeitas ou imperfeitas.
• Sobre a EcoRI:
o Enzima isolada a partir de estirpes de Escherichia coli.
o Na área da biologia molecular ela é utilizada como uma enzima de restrição
originando extremidades coesiva na extremidade 5´de molécula de DNA.
o A EcoRI faz corte na sequência GAATTC do DNA.
o Utilizada em uma grande variedade de técnicas de genética molecular, desde a
clonagem até à supressão de segmentos de DNA in vitro.
Clonagem de DNA
Clonagem do DNA através de clonagem de vetores ou PCR¸ para se originar cópias.
o Vetores de clonagem
▪ Os fragmentos obtidos após utilização de enzimas de restrição podem ser inseridos em vetores,
caso possuam sequencias complementares (têm de ser cortado com a mesma enzima) e estejam
na presença de uma DNA ligase.
▪ Uma pergunta relevante seria o porquê de não se usar a técnica de PCR para obter muitos clones?
A resposta encontra-se no facto do PCR dar origem a fragmentos diferentes e pequenos. Caso
quiséssemos clonar uma sequência comprida, o processo teria pouca eficiência. Por isso, devem-
se usar vetores.
▪ Para ser considerado um vetor de clonagem deve apresentar as seguintes características:
• Capacidade de incorporar DNA exógeno;
• Replicação autónoma;
• Existência de locais únicos de corte por enzimas de restrição;
• Mecanismos de seleção, por exemplo a resistência a um antibiótico;
• Fáceis de purificar;
Transformação
O mecanismo pelo qual a bactéria absorve o DNA que pode ser ou não integrado no seu genoma é denominado
transformação
Vetores de expressão
Os vetores de expressão são utilizados para expressar uma proteína em grande quantidade, para o qual deve ter, um
local de origem de replicação, um promotor facilmente induzível, resistência a um antibiótico, um codão de iniciação,
local de ligação ao ribossoma e ser fácil de purificar.
Por exemplo, inicialmente utilizava-se o operão da lactose: o promotor era deixado intacto e colocava-se uma
nova sequência no meio do gene da beta-galactosidase, contudo isto produzia proteínas mistas e demasiado grandes.
Para além disso, esperava-se que só após a adição da lactose se produzisse a enzima, mas esta era produzida antes da
indução.
Aplicações do DNA recombinante
Terapeutica Comida e agricultura
• Vacinas • Frutas
• Hormonas do crescimento • Vegetais GM
• Anticorpos • Animais GM
• Proteinas recombinantes • Microbios GM
• Medicamentos anticancro
Tecnologia do
DNA
recombinante
Diagnostico Aplicações energéticas
• Terapia genética • Biohidrogénio
• Dispositivos de monitorização • Bioetanol
• Estrategias terapeuticas • Biometanol
• Biobutanol
Saúde e doenças:
o Terapia genética – A terapia genética é uma técnica avançada com grande potencial nos serviços de
saúde. Por exemplo:
▪ Tratamento da ADA-SCID – imunodeficiência primaria.
Neste caso adiciona-se um gene às células estaminais hematopoiéticas através de um protocolo de transferência.
Atualmente, os vetores utilizados para a transferência e para a expressão do gene específico são utilizados lentivírus,
estes são vírus da família do HIV. Este vetor é o mais utilizado e o que possui maior taxa de sucesso para o tratamento
de doenças genéticas humanas.
o Imunoterapia – Esta é uma terapia que consiste em estimular as defesas naturais do corpo humano por
exemplo para combater diferentes tipos o cancro sendo eles o de pulmões, o de ovários, de pele, de
rins, de tumores malignos no SNC, gastrointestinais e cancros do foro hematológico.
▪ Melanoma metastático
▪ Leucemia linfoide crônica
Neste caso a técnica do DNA recombinante é aplicado no acréscimo de um gene que, por sua vez, faz a expressão
especifica de um gene (Melanoma metastático). Outra aplicação desta técnica é no tratamento da leucemia linfoide
crônica em que é feita a manipulação genética dos linfócitos – T para expressar um recetor de antigénio com
especificação para um antigénio dos linfócitos – B (LLC).
As estratégias mais importantes que foram empregadas até agora são a vacinação com células tumorais projetadas para
expressar moléculas imunoestimuladoras, a vacinação com vetores virais recombinantes que codificam antigénios
tumorais e a vacinação com células hospedeiras projetadas para expressar os antigénios tumorais.
Produção de anticorpos e derivados – produção de anticorpos para ajuda no diagnostico e terapia de tumores e
outras doenças.
▪ Doenças em que há a produção de testosterona por hCG estimulado pode ser inibida por um
certo tipo de anticorpos.
▪ Reconhecimento do antigénio responsável por carcinomas através do anticorpo monoclonal
T84.66. (diagnóstico)
Investigação do metabolismo das drogas – por exemplo na investigação da eficácia e do efeito das drogas
através da expressão genética de uma enzima modificada através da técnica do rDNA.
Desenvolvimento de Vacinas e Hormonas recombinantes – quando se compara as vacinas recombinadas com
as convencionais estas apresentam um elevada eficácia e especificidade. Por exemplo:
▪ Vacinas em que o vetor é um adenovírus no qual esta codificado o antigénio de um patógeno,
por exemplo, o vírus influenza.
▪ Produção in vitro da hormona folículo estimulante (FSH) que é importantes para as técnicas de
apoio à gravidez.
▪ Produção da Insulina através da inserção do gene da produção da insulina num plasmídeo que
posteriormente é inserido na E.Coli. A mesma também pode ser produzida através de alfaces
geneticamente modificadas, entre outros. (Vacas transgénicas que produzem insulina através
do leite)
Ambiente – A técnica do DNA recombinante é aplicada na manipulação de bactérias para o tratamento de
problemas ambientais. Por exemplo nas ETAR´s em que se usa bactérias para decompor os dejetos.
▪ Energia:
• manipulação genética das cianobactérias para a produção de hidrogénio;
• produção de bioetanol
• biometanol
• biobutano
Organismos Geneticamente Modificados (OGM)
o Com o desenvolvimento do mundo e das populações, criou-se e desenvolveu-se em 1945 a indústria
agro-alimentar.
o Segundo a União Europeia, “Organismo Geneticamente Modificado (OMG)” é qualquer organismo cujo
material genético tenha sido modificado de uma forma que não ocorre naturalmente. As células têm os
seus cromossomas, os quais por sua vez têm zonas que determinam as características de qualquer
organismo - os genes. Esta tecnologia é por vezes designada por “biotecnologia moderna” ou
“engenharia genética” e permite a transferência de genes individuais selecionados de um organismo
para outro.
• Resistência às espécies. (o cultivo das plantas geneticamente modificadas irá ajudar a eliminar a utilização de
pesticidas químicos e a reduzir o tempo e custo de trazer os alimentos ao mercado).
• Nutrição. (o cultivo de alimentos enriquecidos com vitaminas e minerais especialmente em zonas de pobreza
generalizada.)
• Tolerância às secas. (em zonas com menos terreno disponível para cultivar, as plantas geneticamente
modificadas poderiam ser cultivadas em terrenos antes considerados impróprios.)
Desvantagens:
Ambiental:
• Danos não intencionais a outros organismos: o pólen das plantas GM pode conter toxinas que matam insetos
naquela cultivação e noutros à volta.
• Eficácia reduzida de pesticidas: existe a preocupação que os insetos ficarão resistentes às plantas GM e aos
pesticidas criados especificamente para estas plantas.
Preocupações económicas:
→ Esta tecnologia consiste no uso da técnica do rDNA para clonar e na caracterização de novo CBMs Os CBMs são
módulos de ligação de carboidratos, estes são essenciais em diversos processos biológico, incluindo o
reconhecimento célula-célula, na adesão celular e nas interações entre hospedeiro e patógeno.
INDUSTRIA DO PAPEL
aprimoramento das
propriedas físicas e
mecânicas do papel
INDUSTRIA TEXTIL
Biomedicina
melhoria da afinidade do
•Funcionalização de corante
biomateriais
OUTROS
Ambiente Sondas moleculares,
microarranjos, imobilização de
•Biorremediação
proteínas e células,
engenharia enzimática, etc
DNA complementar (cDNA)
• O DNA complementar (cDNA) é o DNA sintetizado a partir de um molde de mRNA maduro (isto é, molécula só
com exões, após terem sido removidos os intrões) numa reação catalisada por duas enzimas, a transcriptase
reversa e a polimerase do DNA.
• O cDNA é utilizado para clonar genes de eucariontes em procariontes. Isto porque os procariontes não têm
maturação do RNA logo fariam a redução de todo o DNA. Por exemplo, para expressar uma
determinada proteína numa célula onde geralmente não é expressa, transfere-se cDNA que codifica a proteína
para a célula alvo. O cDNA também pode ser produzido por retrovírus, que o utilizam como mecanismo de infeção.
• Os procariontes são organismos muito utilizados em Engenharia Genética como recetores de DNA estranho
porque são fáceis de cultivar, têm um crescimento rápido e processos bioquímicos bem conhecidos. No
entanto, não processam o RNAm e, quando recebem genes com intrões, estes não são retirados e a proteína
produzida não é funcional.
• O método mais utilizado é a partir de mRNA maduro catalisado pela enzima transcriptase reversa. A enzima atua
no mRNA de cadeia simples gerando uma cadeia de DNA complementar.
Processos:
• Todos os cDNA que se sintetizam a partir do RNA podem ser clonados em bactérias, originando uma biblioteca
de cDNA, em que toda a informação (genes que se encontravam a ser transcritos – expressos – num dado
momento), fica armazenada em bactérias por longos períodos de tempo, desde que sejam fornecidas todas as
condições indispensáveis para a sua manutenção.
• É importante referir ainda que a descoberta da transcriptase reversa e do seu mecanismo de ação e,
consequentemente, da tecnologia do cDNA, abriu um importante caminho na biologia molecular. A molécula de
RNA é extremamente instável e, dependendo do RNA em questão, o número de cópias pode estar muito limitado.
• Desta forma, a possibilidade de se trabalhar com o cDNA ao invés de RNA tem facilitado muito o trabalho dos
cientistas, já que o cDNA é uma molécula estável, de fácil manuseamento e a sua multiplicação é bastante simples.
Aplicações:
• O cDNA pode ser utilizado para criar bibliotecas de cDNA, que são arquivos das sequências dos mRNAs de uma
dada célula ou organismo. Tendo a informação de uma biblioteca de cDNA para um organismo permite cloná-lo
noutro organismo, o que é de extrema importância para reproduzir, por exemplo, proteínas importantes para os
humanos em espécies não humanas.
PCR
A reação de polimerase em cadeia é um método rápido que permite a amplificação in vitro de um segmento
específico de DNA ou RNA.
• A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias
(milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA pode ser qualquer objeto de interesse
do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um
marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos.
• Ou então, um assunto muito atual que foi a COVID-19 em que realizamos o teste PCR que se tratava de um teste
molecular que amplifica o material genético do vírus (RNA) e daí ser uma das técnicas mais sensíveis e especificas
para detetar, rastrear e estudar este tipo de vírus.
• Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do DNA, de modo que essa
possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira.
Conclusão
Bio/Webgrafia
https://www.ktb.pt/pt/mente-corpo-saude/Organismos-Geneticamente-Modificados-OGMs
https://rce.casadasciencias.org/rceapp/art/2014/097/
https://biohelp.blogs.sapo.pt/2575.html
https://pt.slideshare.net/ilopes1969/engenharia-gentica-2813620
https://pt.wikipedia.org/wiki/ADN_recombinante
https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.6337396
https://www.journals.uchicago.edu/doi/abs/10.1086/368659?journalCode=osiris
http://graduacao.iqsc.usp.br/files/Aula07BioqII-Qui_TecDNARecomb.pdf
https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.175.4025.949
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673686921926
https://www.science.org/doi/abs/10.1126/science.175.4025.949
https://www.hindawi.com/journals/ijg/2016/2405954/
http://repositorium.uminho.pt/bitstream/1822/35128/1/document_19825_1.pdf