Construção de moléculas de DNA recombinante

Uma especialização da Engenharia Genética

(manipulação genética intencional)

envolve o rearranjo de material genético,

in vitro, por manipulação enzimática

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DNA recombinante
Composto, pelo menos, por dois DNAs de origens
diferentes, que nunca se encontrariam em condições
naturais:
Molécula A Molécula B
Ex:
Digestão de cada molécula
com a mesma endonuclease
de restrição, BamHI
Extremidades
coesivas

Selar com DNA

ligase

DNA
recombinante 2
Propagar DNA recombinante
• O DNA recombinante só têm significado, se for introduzido
numa célula hospedeira onde se mantenha e propague
indefinidamente (clonagem molecular)

• Para que o DNA exógeno se mantenha numa célula, tem que

ser introduzido num replicão apropriado

vetor

-a sua manutenção não requer a integração no genoma do

hospedeiro
-O seu DNA pode ser isolado de uma forma intacta

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Clonar(em Biologia Molecular): outra forma
de copiar DNA

Corte das
moléculas de vetor
Fragmento de
e do DNA, com DNA a copiar
enzimas de
restrição, para Ligação do vetor ao
originar fragmento de DNA,
extremidades com DNA ligase
compatíveis*

DNA recombinante
Introdução em bactérias=
transformação

Molécula de DNA
recombinante
Crpmossoma
bacteriano 4
Clonagem
• Quando um único vetor contendo um fragmento de DNA (vetor
recombinante), é introduzido numa célula hospedeira:

a célula produz grandes quantidades do DNA recombinante,

copia-o cada vez que se divide

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Clone
- Gerado por inserção do fragmento de DNA num vetor que se
pode replicar numa célula hospedeira e dar origem a uma colónia
de células todas iguais

-A clonagem de um gene (no sentido de isolamento) inicia-se

com a construção de um banco de DNA (= coleção de
fragmentos de DNA clonados, que deve incluir fragmentos
representantes de todo o genoma em causa)

- O banco é construído utilizando-se um vetor apropriado (pode

ser um plasmídeo, um vetor derivado de vírus,…) e pode ou não
ser mantido em bactérias.

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 Vetor - definição

Agente que pode transportar um fragmento de DNA

para dentro de uma célula hospedeira

- Se é usado para reproduzir um fragmento de DNA,

designa-se " vetor de clonagem “

- Se é usado para expressar determinado gene

contido no fragmento de DNA, designa-se “vetor de
expressão”

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Os vetores mais comuns (utilizados na
clonagem molecular)

- Plasmídeos
- Vírus- derivados do Fago 
- Cósmidos
- Cromossomas artificiais de levedura (Yeast
Artificial Chromosome; YACs).

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Plasmídeo

-Molécula de DNA em cadeia dupla, circular, que existe

naturalmente nas bactérias e em algumas células eucarióticas
-extra cromossómica  auto-replica-se

-o seu tamanho varia entre 2-3kb e ~ 100 kb

- Vetor plasmídico - construído a partir de um plasmídeo natural,

por remoção de fragmentos não essenciais e adição de outras
sequências:

Região na Vetor
qual o DNA a plasmídico
clonar pode
ser inserido
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Vetor plamídico

Um vetor plasmídico típico contém:

• um polylinker (=MCS, multiple cloning site)

• um marcador de seleção, gene de resistência a um antibiótico
(Ampicilina, tetraciclina,…)
• uma origem de replicação (ORI) para proliferação na célula
hospedeira.
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Polylinker

• Uma porção de DNA reconhecida por múltiplas enzimas de

restrição  o que permite a clonagem (inserção) de fragmentos de
DNA com diferentes extremidades.

• Em geral, tem sítios únicos de corte no vetor

Ex: Inserção de fragmentos Eco RI

Ex: sequência polylinker do vetor pBluescript:

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Marcador de seleção
• Um gene de resistência a uma droga: para amplificação
seletiva (neste caso, um antibiótico: AmpR = ampicilina)

Vetor
plasmídico

AmpR

• Depois de entrar na célula hospedeira, o vetor prolifera com a

célula:
-Sendo a eficiência de transformação dos plasmídeos em E. coli muito
baixa  a maioria das E. coli não interioriza vetor

-Com antibiótico no meio  só proliferam as E. coli transformadas

(resistentes); são eliminadas as que não interiorizaram vetor

-o gene Ampr, expressa a enzima -lactamase, que inativa a ampicilina

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Vírus/fagos como vetores de clonagem

•Fagos - vírus que infetam bactérias

Ex: fago , infeta E. coli

•Vantagens dos fagos como vetores:

-alta eficiência de transformação, ~ 1000 vezes

mais eficiente que o plasmídeo

-maior capacidade de inserção, até 25kb

(plasmídeos comportam até 8kb) 13
Cósmidos como vetores de clonagem

• Uma combinação: plasmídeo + sítio COS

(constituinte do fago ), o que permite que o DNA
recombinante seja inserido em cabeças do fago 

Vantagens:
-alta eficiência de transformação

-consegue inserir até 45 kb de DNA(fago  suporta até

25 kb).
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YACs como vetores de clonagem

• YAC (Yeast Artificial Chromosome)

- vetor capaz de incorporar fragmentos de DNA até 2 Mb

- eficiência de transformação muito baixa

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 Transformação de bactérias

• Incorporação de DNA: ocorre naturalmente numa grande

variedade de bactérias, mas pode-se provocar transformação

-Células bacterianas capazes de incorporar DNA designam-se

células competentes

expressam genes que codificam proteínas específicas:

os fatores de competência (facilitam a ligação e a entrada do
DNA)

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Transformação artificial de E. coli

• Processos que permeabilizam a célula de forma a que esta

consiga introduzir DNA exógeno (que pode ser recombinante):
tornam a célula competente

• Há várias formas de o fazer:

-choque térmico/ Ca2+ ou Mn2+

-campo elétrico
Transformação de E.coli

seguidos de plaqueamento em meio seletivo. 18

Seleção dos clones recombinantes
Clonagem de produtos de PCR- vetores T

• Como clonar produtos de PCR? A Taq DNA polimerase

gera extremidades coesivas 3’ A:

Plasmídeo linearizado
3’ + com extremidades 5´ T
3’

Nota: existem plasmídeos linearizados com extremidades 5’ T

disponíveis em diferentes marcas comerciais

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Clonar produtos de PCR com inserção de extremidades
coesivas

- Inserir, nos primers do PCR, um sítio de reconhecimento para

uma enzima de restrição (seguida de + 3 ou 4 nt). Podem/devem
ser diferentes nas duas extremidades
-Digestão do produto de PCR com a(s) enzima de restrição em
causa:

-Ligação, do produto digerido, ao vetor digerido com extremidades

compatíveis.
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Isolar(clonar) genes de interesse

• Para analisar um gene ou transferi-lo para outro organismo,

este tem que ser localizado e isolado (ex: para transferir o
gene humano da hormona do crescimento para uma bactéria,
há que isola-lo de 3,2 biliões de pb de DNA)

• Poderá ser necessário recorrer a um banco de DNA humano,

para então procurar o fragmento de interesse…
Bancos de DNA
Ex: Permitem isolar um fragmento específico de DNA a partir de
misturas complexas (como sejam os fragmentos de restrição
constituintes de um genoma total, num banco genómico) :

Colónia de
células(clone)
originadas a partir de
uma só célula que
introduziu um
plasmídeo
recombinante
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Bancos(=biblioteca) de DNA - definição

Coleção de fragmentos de DNA clonados no mesmo vetor. Os

bancos de DNA podem ser de:

• DNA genómico- contêm fragmentos de DNA representantes

do genoma inteiro de um organismo

• cDNA- contêm moléculas de DNA complementar, sintetizadas

a partir de todas as moléculas de mRNA de um tipo de
célula/tecido, num dado momento

• de expressão- contém fragmentos de DNA em condições de

serem expressos(em vetores de expressão)
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Construção de bancos de DNA

Bancos de DNA genómico Bancos de cDNA

DNA mRNA
Fragmentação Síntese de cDNA
Inserção em vetores Inserção em vetores
transformação transformação

•Um banco de DNA pode ser rastreado para identificar clones

que contenham a sequência de interesse
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Construção bancos: obtenção do material genético

• DNA genómico: o DNA pode ser obtido a partir de:

• Sangue
• Tecidos
• Amostras paleontológicas
• Amostras forenses (cabelos, esperma, etc)

• cDNA: o mRNA pode ser obtido a partir de:

• Tecidos colhidos imediatamente após a morte
• “ congelados em azoto liquido
• “ armazenados a -80ºC

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Para que servem os bancos de DNA?
• Sequência parcial de um gene
Ex: a partir da sequência de um gene homólogo ou de uma
extremidade de uma proteína

usá-lo como sonda para rastrear um banco e assim

determinar a sequência completa do gene

• A técnica mais comum para identificar clones envolve o

rastreio (screening) do banco de DNA por hibridação com
sondas de DNA ou de RNA, marcadas radioativamente.

28
Rastreio de bancos com sondas de DNA
Ex: Identificação de um clone específico a partir de um banco,
em fago , por hibridação em membrana:

29
Caracterização de clones

- Restrição – eletroforese em gel

- Sequenciação de DNA
- Comparação com base de dados do GenBank
- Bioinformática

Sites de interesse
NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Expasy: http://us.expasy.org/
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Escolha do vetor para construir o banco de DNA

Consoante o tamanho do
genoma:
Genomas
Escolha do
• humano = 3 x 109 bp vetor
apropriado
• E. coli = 4 x 106 bp

Considerando 1 bp = 1 mm ?????:

• genoma humano = 3000 km

• genoma E. coli = 4 km
• gene de uma proteína c/ 50 kDa = 2m

31
Tipos de vetor- bancos cDNA e de DNA genómico

cDNA library cDNA library

32
Sequenciação de DNA
Sequenciação de DNA
• Existem varias técnicas moleculares que tornam possível
determinar a sequência de um DNA

• Os diferentes métodos de sequenciação permitem determinar

rapidamente a sequência de bases do DNA, com  ou <
precisão, consoante a técnica, podendo fornecer informação
sobre a estrutura génica e função
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Métodos clássicos: sequenciação de DNA
Dois métodos clássicos:

▪ Método químico ou de Maxam e Gilbert (anos 70): as

moléculas de DNA são marcadas radioativamente
(extremidade 5’) e são sujeitas a 4 reações químicas
paralelas (Gs, Cs, Ts, As).

▪ Método enzimático ou de Sanger (anos 70): método da

terminação em cadeia.

Tornou-se rapidamente o método standard para

sequenciar fragmentos de DNA purificados
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Sequenciação de DNA- método enzimático
(= Sanger = dideoxy = terminação em cadeia)

• Polimerização do DNA a sequenciar (molde) na presença de:

-DNA polimerase (F. Klenow)
-um primer
- dNTPs
- ddNTPs

(F. Klenow: copia a sequência de DNA, em cadeia simples ou previamente

desnaturado e hibridado com o primer, usando dNTPs)

36
Método de Sanger
• Base do método: incorporação de terminadores de cadeia
de cada um dos 4 nucleotídeos (ddNTP)

3’ OH usado para a ligação Não tem 3’ OH: quando

fosfodiéster incorporado, a síntese de DNA
termina

ddNTPs (análogos dos dNTPs, sem grupo OH na posição 3’ da pentose) não

se formam mais ligações fosfodiéster  a cadeia termina quando o ddNTP é 37
incorporado
 Sequenciação de DNA- método enzimático

• As reação é efetuada com os 4 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) e

com baixas concentrações dos 4 ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP,
ddTTP: cada um marcado com um fluoróforo ) de modo a obter uma mistura
de cadeias, marcadas, que terminam em vários pontos

• A etapa final é a separação dos fragmentos obtidos:

* eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante(ureia)

(DNA neo-sintetizado marcado com fluoróforo ou com um radioisótopo)
ou

* eletroforese capilar: marcação fluorescente/ seq. automática

(DNA neo-sintetizado marcado com fluoróforo)

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Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante(ureia): marcação com isótopo
radioativo
Corantes fluorescentes = fluoróforos

• Moléculas que absorvem e emitem fluorescência a

comprimentos de onda específicos
(Ex: derivados de fluoresceína e de rodamina)

• Para serem usadas em sequenciação, estas

moléculas são ligadas covalentemente a cada um dos
nucleótidos

40
Marcação com corantes fluorescentes

• Sequenciação com os terminadores marcados (ddNTPs),

4 fluoróforos diferentes estão ligadas covalentemente a cada

um dos 4 ddNTPs, ficando a cadeia neo-sintetizada marcada

na extremidade 3’

41
Sequenciação de DNA- marcação do ddNTP
Ex: Incorporação do nucleótido marcado (ddGTP) com um
composto fluorescente (um fluoróforo  para cada ddNTP): a
cadeia neo-sintetizada fica marcada:
Ex:

- Esta reação é realizada, em simultâneo, com o ddATP,

ddTTP e ddCTP, cada um marcado com um fluoróforo  . 42
Sequenciação automática de DNA- método enzimático
A reação é realizada
num termociclador e,
em geral, os produtos
são separados por
eletroforese capilar

Um detetor e
um computador são acoplados

Eletroferograma:
a cadeia de DNA é lida pela
ordem dos fluoróforos que saem
do gel ou do capilar 43
Sequenciação automática de DNA

• O padrão dos picos do eletroferograma reflete

mutações ou alterações de sequência:

T/T T/A A/A

5′ AGTCTG 5′ AG(T/A)CTG 5′ AGACTG

44
Outras tecnologias de sequenciação: Next-Generation

• Surgiram novos métodos de sequenciação, Next generation,

que permitem sequenciar centenas de vezes mais rápido e
mais barato que o método de Sanger

• A maioria destas metodologias sequencia em paralelo, o que

significa que são sequenciados simultaneamente milhões de
fragmentos:

-Pirosequenciação
-Sequenciação “Illumina”
-Sequenciação “Third-generation”
45
 Pirosequenciação

46
Pirosequenciação

• Cada nucleótido é adicionado sucessivamente

• Só um dos 4 vai gerar sinal de luz
• Os nucleótidos restantes são removidos enzimaticamente
• Os sinais de luz são registados num pirograma:
DNA sequence: A T C A GG CC T

Nucleotide added : A T C A G C T
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 Sequenciação Illumina (semelhante ao mét. de Sanger)
• Nucleotídeos com um tag fluorescente,  para cada nucleótido, com
um terminador (grupo químico: nucleot*) que, uma vez incorporado
na cadeia de DNA, previne incorporação de mais nucleótidos
(contrariamente ao método de Sanger, o terminador é removido):
-o DNA é 1º fragmentado em milhares de fragmentos
sobreponíveis
- os fragmentos são adsorvidos a uma lamina e amplificados,
criando-se grupos de cerca de 1000 copias de cada fragmento,
próximos uns dos outros na lamina
-os fragmentos de DNA são desnaturados e adicionada uma
solução de: primers, DNA polimerase, nucleot* modificados
-o primer liga-se a cada fragmento de DNA, é incorporado o
1ºnucleot., a solução é lavada e o nucleot* é excitado com laser
 fluorescência, que revela o nucleot* incorporado(A,C,G,T)
-o terminador e o tag são quimicamente removidos e o processo
é repetido…
 Sequenciação Illumina

(a) Este método usa o terminador

reversível Illumina/Solexa's 3′-O-
azidomethyl em agrupamentos de
DNA amplificados em fase sólida,
exemplificados na imagem como
single templates.

Após imaging, um passo de clivagem

remove os corantes fluorescentes e
regenera o grupo 3′-OH

(b) As imagens de 4 cores mostram os

dados de sequenciação de dois
“templates “

Nature Reviews Genetics 11, 31-46 (January 2010)

Sequenciação Third-generation
• Estão em desenvolvimento métodos, mais avançados e mais
rápidos, designados Third-generation sequencing methods.

Exemplo:
• Sequenciação em nanoporo de moléculas individuais de DNA:
- Uma cadeia simples de DNA é feita passar por um nanoporo de
uma membrana
- Ao passar pelo nanoporo a molécula altera uma corrente elétrica
na membrana, alteração que depende da forma da molécula que
passa no poro: cada uma das 4 bases do DNA causa uma
alteração característica  a sequência do DNA pode ser lida
pela a análise da corrente da membrana à medida que a cadeia
passa através do poro, um nt de cada vez
- Um só chip tem centenas de milhares de nanoporos, pelo que se
conseguem ler muitas cadeias de DNA simultaneamente
- Um dos objetivos da Third-generation sequencing é consiguir
sequenciar o genoma completo por menos de 1000$
Bibliografia recomendada:
[1] Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. “Molecular Cell Biology”. 9th Ed (ou edições
anteriores). New York: W. H. Freeman, 2021(Chap 6)

[2] José Luque, Angel Herraez “Biologia Molecular e Ingenieria Genética”- Conceptos,
técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud. Elsevier, 2006(Tema 16, 18)

[3] Benjamin A. Pierce; “Genetics - A Conceptual Approach”. 5th Edition, May 2014. W. H.
Freeman Publisher. ISBN 9781464109461(Chap 19)

[4] NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/