Biotecnologia

Profª Natália Faria Romão

Bióloga / Mestre em genética e toxicologia
Doutoranda: Biotecnologia - UFAM
Coord. De Atividades: C. Biológicas, Biomedicina e Enfermagem
 Técnica do DNA Recombinante

• Essa técnica permite fazer a introdução de um

segmento de DNA de um organismo, em um
outro ser, formando os OGMs (organismos
genéticamente modificados.

• O objetivo é introduzir o gene que codifique

uma determinada proteína a fim de que o
organismo que receberá esse gene seja capaz
de expressá-lo.

• Essa técnica também recebe o nome de

Clonagem gênica.
 Técnica do DNA recombinante

• Para a eficácia da técnica necessita então de

chamados vetores:

– Plasmídeos bacterianos

– Vetores virais

– Vetores cromossômicos

Vetores: veículo do gene, ou seja

através deste que o gene entrará
no indivíduo receptor.
 Técnica do DNA Recombinante

Vetores plasmídiais

• Fragmentos de até 15.000

pb.
• DNA extracromossomal de
bactérias.
• Necessidade de inserção em
linhagens bacterianas para
replicação do inserto
clonado no plasmídio.
• Preparação de receptores
competentes.
 Técnica do DNA Recombinante
Vetores plasmídiais
 Técnica do DNA Recombinante
pBR322
Vetores plasmídiais

• Seleção por perda de

resistência
• Insertos de maiores
tamanhos (cerca de até
5Kb)
• Réplicas de placas
(sistema de
transferência com o
veludo)
 Técnica do DNA Recombinante

Vetores plasmídiais pUC18/19

• Seleção por perda de
coloração das colônias
com plasmídios
contendo o inserto de
interesse.
• Fragmentos de até 3kb
(perda de eficiência da
ligação)
• Facilidade em
sequenciar os
fragmentos clonados.
 Técnica do DNA Recombinante

Vetores de expressão

• Utilizado também em plasmídeos.

• Inserção do gene de interesse sobre o controle
de um promotor forte (expressão da proteína
alvo);
• Fusão do gene alvo com genes reporters,
sequências protéicas (lacZ, gfp, his-tag)
 Técnica do DNA Recombinante

Vetores de expressão
 Técnica do DNA Recombinante

Vetores virais

• Insertos maiores que em plasmídios (até

23.000 pb para fagos)
• A maioria  fago labda
• Genoma do fago: 48.502pb
• Empacotamento do fago in vitro
 cII empacotamento
cro O
cI P Fago
N
Q
cIII
Fago 
48,514 kb SR

Head Tail

AWbcNu3DEFiFiiZU V G Thmlki J att int xis    cIII N cI cro cII O P Q SR

Head Tail Recombinação Regulação Replicação Lise

 Técnica do DNA Recombinante

Vetores cosmídios

• É um híbrido entre plasmídeos e o fago labda

• Vantagens: capacidade do plasmídeo de
replicação autônoma
• Capacidade do fago de embalagem do
cromossomo
• Capacidade de 35 a 45kb
 Técnica do DNA Recombinante

Vetores cosmídios

Região cos : empacotamento

das pastículas virais

Ciclo Lítico necessário

Ap
Utilização em bactéria e fago
(shuttle)
Região de polylinker
Genes de seleção
ori por resistência à antibióticos
 Técnica do DNA Recombinante

Vetores cromossômicos

• YAC (Yeast Artificial Chromosomes)

• BAC (bacterial artificial chromosomes)

• PAC (plant artificial chromosomes)

 Técnica do DNA Recombinante

Vetores cromossômicos

• Clonagem de maiores
fragmentos de DNA
 Técnica do DNA Recombinante
Células hospedeiras
Célula procariótica Célula eucariótica

Escherichia coli; Bacillus Leveduras: Saccharomyces

subtitis cerevisae; Pichia pastoris

Insetos: Drosophila
melanogaster; Aedes
albopictus; Spodoptera
frugiperda
Células de Mamíferos – in
vitro
 Técnica do DNA recombinante

Gene clivado

DNA de um hospedeiro

Transcreverá o gene

Formará proteína desejada

 Técnica do DNA recombinante
• O hospedeiro deve ser um indivíduo que se
reproduza rapidamente – bactérias.
 Técnica do DNA recombinante

• A técnica:
 Cortar o DNA
com enzimas
de restrição
Fragmento 1 Fragmento 3
Fragmento 2 Fragmento 4

Inserir
fragmentos em
vetores

Introduzir
vetores em
bactérias por:
eletroporação
ou choque
térmico
Métodos de introdução do DNA no hospedeiro

• Transformação bacteriana
• Transfecção
• Electroporação
• Microinjeção
• Infecção viral
• Bombardeamento com microprojeteis
Métodos de introdução do DNA no hospedeiro
Métodos de introdução do DNA no hospedeiro

Transformação da bactéria

• Choque térmico
• Eletroporação
• Biobalística
Transformação da bactéria
 Transformação da bactéria

Eletroporação
 Transformação da bactéria
• Eletroporação:

– Misturam bactérias e o vetor num único tubo e

aplica-se um choque elétrico na mistura, com o
objetivo de desestabilizar a membrana e
permitir a entrada do vetor na bactéria.
–
– Ela é então rapidamente transferida para meio
de cultura e incubada a 37ºC para que se possa
recuperar após o choque.
 Transformação da bactéria
ELETROPORAÇÃO
Biobalística Transformação da bactéria
 Transformação da bactéria
Biobalística
• Uso de partículas diminutas (1,0 a 1,5 mm) de
tungstênio ou ouro, que são revestidas com DNA a
ser transferido.
• As partículas podem ser acelerados por ar
comprimido (Hélio), onda de choque elétrico e
pólvora entre outros; com força suficiente para
penetrarem na camada exterior da parede das
células de um tecido alvo, com isto, uma quantidade
de DNA das partículas localiza-se no núcleo das
células do tecido utilizado, o qual passa incorporar o
novo DNA.
 Transformação da bactéria

Biobalística
• Todo o processo ocorre no interior de uma câmara
sob vácuo, para evitar a desaceleração das partículas
causadas pelo ar.
• É uma técnica bastante versátil, pois permite além da
transformação de um genótipo, pode também ser
utilizado para uma organela como a mitocôndria ou o
cloroplasto.
• É relativamente simples, rápida e não envolve muito
investimento de infra-estrutura e equipamentos.
Plaqueamento
 Técnica do DNA recombinante

• Necessário para que a técnica seja bem

sucedida:
– Enzimas de restrição
– DNA alvo
– PCR para amplificação do gene alvo (inserto)
– Eletroforese para que se separe os genes
– Vetor
– Receptor que produzirá a proteína desejada
– Meios de cultura do receptor
– Técnicas de purificação da proteína produzida