FERRAMENTAS DA

BIOTECNOLOGIA

Juliana Vitória Messias Bittencourt

Eng. Agrônoma, PhD
UTFPR – PG
Laboratório de Bioengenharia
Técnicas básicas

• PCR

• Eletroforese

• Sequenciamento
 

Polymerase Chain Reaction
Reação de polimerização em cadeia
ou
Polimerização em cadeia do DNA

PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in

vitro”, usando os elementos básicos do processo
de replicação natural do DNA.
 PCR se constitui hoje no método de
rotina para isolar rapidamente
seqüências específicas a partir de DNA
genômico ou de cDNA

Marcador monomórfico
Marcador polimórfico
Evolução da PCR

Década de 70 - início das técnicas de

manipulação de DNA

Enzimas de restrição

Pequenos fragmentos de DNA

Isolamento e clonagem de genes

Década de 80 – descoberta da PCR (1985)

• Apresentada pela primeira vez na Conferência da Sociedade

Americana de Genética Humana (1985)

• Publicação na Science (1988)

• Cetus Corporation vendeu a patente para Hoffmann-La

Roche Inc. por $ 4,7 milhões (1989)

• Prêmio Nobel de Química (1993)

“ Somethimes a good idea comes

when you are not looking for it”
Kary Mullis
1989 – Automação da PCR

• Taq DNA polimerase

– DNA polimerase termoestável

• Thermus aquaticus
– Extremófila encontrada em fontes
hidrotermais

Thomas D. Brock no lago do

“Yellowstone National Park”
de onde foi isolado a bácteria
Impacto da PCR

Impacto em 4 áreas principais da biotecnologia:

✓ Mapeamento genético
✓ Clonagem
✓ Sequenciamento de DNA
✓ Diagnóstico genético
Indústria de biotecnologia

Tipos de termocicladores

• Aquecimento e resfriamento por fluídos

• Aquecimento por resistência eléctrica e
resfriamento por fluídos ou por
circulação refrigerante
• Aquecimento por resistência eléctrica e
resfriamento por semicondutores
• Aquecimento por luz seguido de
resfriamento por ar
 Indústria da biotecnologia

Reagentes
Microtubos Microcentrífugas

PCR Real Time

Taq Micropipet
recombinantes a
Características
■ Específica: amplifica uma seqüência alvo

DNA

DNA Supercoiled

Cromossomo

Replicação in vitro do DNA

Consiste em uma reação de síntese de regiões específicas de DNA em

ciclos repetidos
 O que é necessário?

Mg2+ DNA polimerase

termoestável
dCTP
dGTP Primer
dNTPs
dTTP
dATP

Solução: tampão de PCR, H2O milliQ (pH 7,0) e óleo mineral

 Desnaturação
• Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de
DNA por meio da elevação da temperatura

■ As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante um a vários

minutos
 Anelamento
• A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante alguns mi

• Os primers se anelam com com as seqüências

complementares do DNA molde
 Extensão
• Aumento da temperatura a 72ºC durante 2 minutos

• Ação da DNA polimerase com os primers que se

anelaram, inicia-se a polimerização da nova fita
utilizando os nucleotídeos complementares
disponíveis
 Ciclos interativos e consecutivos

Anelamento
do Primer (Tm)

Desnaturação Extensão
94oC do Primer
72oC
 Após 30 ciclos 230 = 1.073.741.824 fragmentos

Acúmulo exponencial de fragmentos amplificados

A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers)

Polimerização sentido 5’-> 3’

O pareamento dos primers com a seqüência

molde ocorre pelo estabelecimento das pontes
de hidrogênio, obedecendo o pareamento
convencional descrito por Watson e Crick:

A =T
C =G
Técnicas básicas

• PCR

• Eletroforese

• Sequenciamento
 Eletroforese

- Conhecida desde 1930

- Difundida 1950-1960
- Movimentação de moléculas – campo elétrico
- Matriz – Agarose / Poliacrilamida
- Separa proteínas – carga elétrica / peso molecular

- Separa ácido nucléico – peso molecular

goulart@ucg.br
ELETROFORESE

É uma técnica usada para separar

misturas complexas de
macromoléculas, normalmente
proteínas e ácidos nucléicos.
Seu princípio é submeter
amostras, aplicadas em
pequenos poços de uma matriz
porosa submersa em um
tampão, a um campo elétrico.
As moléculas migram a uma taxa
que é dependente de sua carga
elétrica e de seu peso
molecular.

Eletroforese

goulart@ucg.br
 Marcador molecular
• são características de DNA que
diferenciam dois ou mais indivíduos e
são herdadas geneticamente.

Marcador monomórfico
Marcador polimórfico
 Teste de paternidade
•
Técnicas básicas

• PCR

• Eletroforese

• Sequenciamento
Sequenciamento
Sequenciamento automático
 Aplicações
• Técnicas de Biologia Molecular:
- clonagem de genes
- mutagênese

• Diagnóstico :
- diagnóstico clínico (mutações, infecções bacterianas e
virais)
- diagnóstico genético (pré-natal)

• Técnica de DNA fingerprinting

- medicina forense (estudos de criminologia, testes de
paternidade)
- melhoramento genético/ Análise populacional

• Ecologia
- estudos de diversidade genética

• Antropologia genética