UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE ENGENHARIA CIVIL E AMBIENTAL

ENGENHARIA AMBIENTAL E SANITÁRIA

Disciplina BIOLOGIA GERAL

Técnicas de Biologia Celular e Molecular

Profa. Katia Saavedra

2017
 CONTEÚDO

Métodos Tradicionais

Métodos Moleculares
M
I
C
R
O
S
C
O
P
I
A
 Microscópio
 Início (1600):
- Incorporação do microscópio aos estudos anatômicos.
- Desenvolvimento de técnicas de preparo para a visualização
dos materiais biológicos.

1663 1689 1750 1852

Robert Hooke Marcello
Malpighi
 (1689)

Introdução da microscopia à medicina

Estudo de capilares

Médicos: Rejeitaram microscopia – inútil

Descrições sobre os capilares eram falsas

Anatomia comparada era irrelevante para medicina

Anatomia humana → só era útil para descrição

Marcello Malpighi
(1628-1694)

“ Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena,

interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso
a nenhum médico”
Sistema de lentes combinadas, que são colocadas de forma a
ampliarem a imagem do objeto

Interação da luz
com o espécime

Absorção ou Refração dos

raios de luz

Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve

 Microscópio
 Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia

produção de imagens aumentadas de

objetos não visualizados à olho nú

1) De luz (ML) / óptico (comum)

Modificado (variações) com propósitos especiais
➢ Contraste de fase ➢ Invertido
➢ Polarização ➢ Fluorescência

2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons

➢ Microscópio eletrônico de transmissão (MET)
➢ Microscópio eletrônico de varredura (MEV)
Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho
 Tipos de Microscópios

Microscopia de Luz Microscopia eletrônica

Microscopia convencional Microscopia eletrônica de
Microscopia de contraste de fase transmissão
Microscopia de contraste interferencial Microscopia eletrônica de alta
Microscopia de campo escuro voltagem
Microscopia de polarização Microscopia eletrônica de
Microscopia de fluorescência varredura
Microscopia com focal a laser

Outros tipos de microscópios

Microscopia de tunelamento quântico
Microscopia de força atômica
 Aplicações da Microscopia de Contraste de fase
Análise do material biológico sem coloração prévia:
1. Culturas de células
2. Exames parasitológicos
3. Esfregaços e raspagens de mucosas Diferenças de índices
4. Sangue de refração
5. Protozoários de ambientes aquáticos
6. Algas
7. Bactérias

Sem coloração

Cultura de células: neurônios

Bactérias
Microscopia de Fluorescência

Baseia-se na:
Propriedade física de
algumas substâncias
absorverem a luz, em um
determinado
comprimento de onda, e
emitirem luz com
comprimentos de onda
maiores e níveis
energéticos mais baixos

Microscopia de fluorescência
mostrando uma célula embrionária de
Caenorhabditis elegans em divisão
 MÉTODOS
MOLECULARES
 RNA ribossômico (RNAr)

 Contribui para a estrutura do ribossomo.

 16S rRNA – iniciação da síntese de proteína.

 Evidencia de que desempenha um papel

fundamental nas atividades catalíticas do RNA.
 Presente em todos os organismos.

 Altamente conservado.

 Difícil transferência lateral.

 Relativamente fácil de isolar e caracterizar.

 Grande banco de dados (GenBank).

Reator Anaeróbio Horizontal de Leito Fixo
Grânulo anaeróbio
aumento: 7X

Corte grânulo
aumento: 7X
Reatores biológicos
 Extração dos ácidos nucléicos

• Vários protocolos:

➢ Química: detergente SDS.

➢ Física ou mecânica: pérolas de vidro (glass
beads).
➢ Enzimática: lisozima.
 Extração dos ácidos nucléicos
➢ solução Tampão - manter o pH ótimo
➢ centrifugação
- separação outros componentes celulares
- separação fase aquosa e orgânica
➢ fenol - desnatura proteína
➢ clorofórmio - solubiliza lipídio e fenol
➢precipitação do DNA com etanol 100%
➢ água estéril
Cuba eletroforética
Visualização no uv do DNA
 Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)

 Descoberto por Kary B. Mullis em 1983.

 É o método in vitro de síntese enzimática de

uma seqüência específica de DNA.
 Características do PCR

 Processo cíclico:
•15 a 40 ciclos.
•Realizado por mudanças de
temperatura.
 Específico
 Sensível
 Flexível
 Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)
 São utilizadas duas seqüências de
oligonucleotídeos (primers) que hibridam nas
fitas opostas do DNA.

 A série repetida de ciclos envolve:

desnaturação do DNA, anelamento dos
primers e extensão dos primers pela DNA
polimerase.
 Função dos primers

 Sintetizados quimicamente.

 Entre 18 a 24 bases.

 Define os limites do DNA alvo a ser

amplificado.
Anelamento dos primers
Molde

Síntese de nova fita de DNA

Extensão dos primers

 REQUISSITOS

 DNA ou RNA molde.

 DNA polimerase.

 Primers.

 dNTPs.
CICLOS DE TEMPERATURA
 Desnaturação do DNA

 94 a 100º C.

 Desnaturar DNA alvo.

Desnaturar produtos de ciclos

prévios.

 4 a 10 min. de desnaturação inicial.

 Duração de 30 seg. a 1 min.

 Anelamento dos primers

 40ºC a 70ºC.

 Temperatura de “hibridização”.

 Otimização da temperatura para cada

par de primers.

 Tipicamente 30 seg a 2 min.

 Extensão dos primers
 72ºC.
 Taq polimerase.

Faixa de atividade:
20ºC a 85ºC.

Atividade varia 100x nessa faixa.

 Tempo de extensão varia de acordo com

tamanho do produto desejado.
 Inibidores do PCR

 SDS
 EDTA
 Fenol
 Etanol
 Isopropanol
 Acetato de sódio
 Cloreto de sódio
 Uréia
Termocicladores
 PCR
• Visualização do produto de PCR -
migração em gel de agarose.

2000
1200
800
400
200
 Métodos baseados em PCR

 Eletroforese em gel de gradiente desnaturante

(DGGE).

 Polimorfismo do comprimento dos fragmentos

de restrição terminal (T-RFLP).

 Análise de restrição do DNA ribossomal

amplificado (ARDRA).

 Análise do espaço intergênico ribossomal

(RISA).
 IMPORTÂNCIA

 Para a sistemática microbiana, o PCR é o

método básico para obter cópias de
segmentos de DNA genômico para
clonagem e seqüenciamento de genes
utilizados na caracterização e identificação
de microrganismos.
 DGGE
(Eletroforese em gel de gradiente desnaturante)
 DGGE

 Método eletroforético originalmente

desenvolvido para diferenciar mutações
de uma base em genes homólogos
amplificados.

 Consiste na separação dos

fragmentos do DNA de mesmo
comprimento, mas com seqüências
diferentes.
 DGGE

 A separação se baseia no decréscimo

da mobilidade eletroforética da fita de
DNA.

 Separa a fita de DNA baseando-se nas

suas características de dissociação.
 DGGE

 A temperatura em que o DNA se

dissocia depende de sua sequência..

 Para ajudar na dissociação do DNA

um agente desnaturante pode ser
adicionado.
 Cuba de
eletroforese
 Primavera Verão Outono Inverno
S CI AS S CI AS S CI AS S CI AS
30%

80%

Gel de DGGE com primers pufM.557FGC e pufM.750R - T3

 Verão Outono Inverno
S CI AS S CI AS S CI AS
20%

60%

Gel de DGGE com primers 341FGC e 907R – T1

 Clonagem

•Isolamento do fragmento de interesse - DNA

➢ Produto do PCR
•Junção dos fragmentos de DNA a um vector
de clonagem pela ação da DNA ligase.
➢ Plasmídeo
-Permitir a recombinação do DNA
estranho.
- Fatores de resistência a antibióticos.
 Clonagem
Incorporação num hospedeiro.

-Transformação da célula ou por

infecção da célula. Detecção e
purificação do clone requerido.
- - galactosidase - hidrolisa X-gal (azul).
Clonagem
Produção de DNA recombinante


 Seqüenciamento
• Método preciso e informativo para a
identificação de organismos.

• Permite a identificação de
organismos nunca antes cultivados
em amostras complexas.

• Trabalhoso, demanda tempo,

equipamento e treinamento técnico
especializado.
 Sequenciamento

• Determinação da seqüência de
nucleotídeos de regiões definidas do
genoma do microrganismo.
• Alinhamento - eliminação das
“quimeras” (programa SeqMan).
• Banco de dados online NCBI-Blast.
Sequenciador capilar
Os fragmentos de diferentes comprimentos migram no gel, os menores na
frente. São iluminados por um feixe de laser e fluorescem quando
atravessam a janela do feixe. Os géis têm sido substituídos por capilares
preenchidos de polímero nas máquinas mais modernas.
Seqüenciamento