Biologia Celular - Laboratório

2023/2024

8ª AulA
Microscopia ótica

Campo Claro
Campo Escuro
Contraste de fase
Fluorescência
Microespectroscopia
Super-Resolução
 Microscopia de contraste de fase
Utilização: observação de células e tecidos vivos
Fundamento: pequenas diferenças no índice de refracção e na
espessura entre o objecto e o meio
Esquema do Microscópio de contraste de fase
9 – olho
8 – ocular
7 – placa de fase
objectiva
6 – luz refractada
5 – luz não refractada
4 – amostra
3 – condensador
2 – diafragma anular
1 – fonte de luz
 Contraste escuro ou positivo
• placa de fase
 Contraste brilhante ou negativo
• placa de fase
 1
4
Microscópio de contraste de fase

5
3

Células HeLa vivas

Ampliação 200x, contraste de fase brilhante ou
negativo
1 – Oculares 4 – Iluminação
2 – Objectivas 5 - Anel de fase https://www.youtube.com/watch?v=ozokXq0pzo0
3 – Condensador
Microscopia de Fluorescência
 Citoquímica
localização química de componentes celulares

COR

microscopia óptica

Campo claro Fluorescência

4a aula de laboratório
8a aula de laboratório – hoje!
 Fluorescência e Fluorocromo

Fluorescência – fenómeno pelo qual algumas

moléculas quando expostas a radiações do tipo UV,
invisíveis ao olho humano e de baixo c.d.o., as
absorvem transformando-as em luz visível, ou seja,
há uma emissão de c.d.o. maior que o da radiação
incidente.

Fluorocromo ou Fluoróforo – molécula ou parte

de uma molécula que ao ser excitada por uma luz
de menor c.d.o. (ex. luz UV) emite luz de um c.d.o.
maior (luz visível), ou seja, é fluorescente.
 Espectro luz visível

Os comprimentos de onda (c.d.o.; λ) tipicamente usados em microscopia estão na gama dos nanometros (nm), espectro
do visível (400-700nm), espectro UV (400nm) e espectro IV (700nm)
Microscópio de Fluorescência
 Microscópio de Fluorescência
Aquisição de imagens Imagem epifluorescente de uma célula
cancerosa humana em divisão:

 O DNA está marcado a azul (DAPI), a

INCENP (inner centromere protein) aparece
verde (GFP) e os microtúbulos a vermelho
(Rodamina).

 Cada fluoróforo é processado em

separado, utilizando uma combinação
diferente de filtros de excitação e
emissão; as imagens são capturadas em
sequência com uma câmara digital.
 O programa de processamento de
imagem faz a sobreposição das três
imagens
 Sondas fluorescentes
 Existe uma grande diversidade de moléculas fluorescentes que são usadas em investigação.
 As sondas fluorescentes podem ser utilizadas para deteção de determinadas proteínas bem como
para monitorizar a sua localização e ativação, permitindo assim a monitorização de processos
biológicos
 São também utilizadas para visualização/ localização de organelos celulares

Fluorescence SpectraViewer (thermofisher.com)

https://www.thermofisher.com/pt/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-
resource-library/pierce-protein-methods/fluorescent-probes.html
 Citoesqueleto – Imunofluorescência
IMUNOFLUORESCÊNCIA
• marcação da tubulina dos microtúbulos com Ac anti-tubulina β*

cellsignalling antibodies.com
 Citoesqueleto – sondas fluorescentes
SONDAS FLUORESCENTES
• marcação da actina (citoesqueleto)– faloidina+rodamina

Phalloidin
Faloidina

Rodamina
E. Rodrigues/A. Carvalho

Fluorescência laranja-vermelha muito brilhante e estável. Excitação 540 nm; emissão 565 nm
 Sondas fluorescentes
SONDAS FLUORESCENTES
• marcação do DNA (núcleo) – DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)
DAPI
DAPI

Marcador fluorescente que se liga fortemente a

regiões de DNA ricas em adenina-timina
E. Rodrigues/A. Carvalho

Excitação 358 nm (ultravioleta); emissão 461 nm (azul)

 Sondas fluorescentes
SONDAS FLUORESCENTES
• marcação das mitocôndrias – mitotracker

Mitotracker

 Existem sondas para investigar a função mitocondrial e

sua influência no metabolismo e na saúde celular.

 As sondas MitoTracker são corantes catiónicos

interiorizados seletivamente por mitocôndrias em
células vivas, devido à sua carga; dependem do
potencial de membrana para entrarem nas células.
E. Rodrigues/A. Carvalho

 Há vários fluoróforos disponíveis, o que permite usar

vários λ.
Avaliação da morfologia da rede mitocondrial
 Sondas fluorescentes
SONDAS FLUORESCENTES
• marcação de Lisossomas – Lysotracker red
 Os Lisossomas são organelos acidicos, pH 4.0 a 5.0, que contêm
enzimas digestivas (hidrolases).

 São fundamentais para a homesostase celular.

 A existência de técnicas que permitam visualizar e acompanhar

o estado funcional dos lisossomas é muito importante.

 LysoTracker® são sondas constituídas por um fluoróforo ligado a

uma base fraca que fica parcialmente protonada a pH neutro e
thermofisher
assim conseguem entrar nas células vivas, por difusão.

 As sondas LysoTracker® são altamente selectivas para organelos

acídicos, não necessitando de um anticorpo para detecção.
Proteínas Fluorescentes
Doença de Niemann-Pick de tipo C (NPC) 3a aula laboratório

A doença de Niemann-Pick de tipo C (NPC) é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela

acumulação de colesterol e outros lípidos nos endossomas tardios/ lisossomas, com opções terapêuticas
limitadas.
 3a aula laboratório
Coloração com Violeta de Cresil (Nissl staining)

Normal brain Niemann-pick brain

Mice Brain
Cerebellum

400X 400X
Cortes sagitais corados com acetato de violeta de cresil do encéfalo de murganhos wild-type e de um modelo animal da
Doença de Niemann-Pick de tipo C (Npc1tm(I1061T)), que têm um knock-in da mutação NPC1I1061T, a mutação mais comum
em pacientes de NPC1.

(1) M. Praggastis et al., “A murine Niemann-Pick C1 I1061T knock-In model recapitulates the pathological features of the most prevalent human disease allele,” J.
Neurosci., vol. 35, no. 21, pp. 8091–8106, 2015, doi: 10.1523/JNEUROSCI.4173-14.2015.
Proteínas Fluorescentes
8a aula laboratório –
hoje!
GFP
 Rainbow Neurons

Genetically engineered "brainbow” mice express random combinations of cyan, yellow, and red fluorescent proteins in
nerve cells. As a result, neurons and their projections are labeled with a multitude of distinct hues. In this image from a
portion of the cerebellum, a brain area involved in movement and balance, the multicolor labeling reveals the intricate
meshwork created by long neural projections that connect to cerebellar neurons. (These connections, also called
synapses, are seen here as large spots.)
 O que vão ver hoje…
Lâminas Neurons Microglia
Cérebro de Ratinho

Neurónios (sobrexpressão de GFP)

Microglia (imunofluorescência Ac1’ anti- E. Rodrigues/A. Carvalho M.J. Gama/A. Carvalho

Iba1 – marcador de microglia +
Ac2´AlexaFluor 568 ) Astrocytes

Astrócitos (imunofluorescência Ac1’ anti-

GFAP – marcador de astrócitos +
Ac2´AlexaFluor 568 )
M.J.Gama/ A. Carvalho
 O que vão ver hoje…
Caixas
Phalloidin DAPI
Células HeLa

Faloidina+Rodamina

DAPI
E.Rodrigues/ A. Carvalho E.Rodrigues/ A. Carvalho