Métodos de estudo da célula

Dimensões das
estruturas celulares
e
subcelulares
• Célula vegetal: ± 50µm
• Célula animal: ± 10-20µm
• Bactérias: ± 1-2µm
• Vírus: ± 0,05µm

• Núcleo: ± 3-6µm
• Mitocôndrias: ± 0,5µm
• Ribossomos: ± 25nm
• Membrana: ± 10nm
 Como visualizar células e
diferentes estruturas celulares?
 Métodos de investigação da estrutura
celular

Microscopia óptica (ou microscopia de luz)

Descobrimento da célula e formulação da teoria celular

Técnicas citoquímicas
Identificação e localização de diversas moléculas
constituintes das células

Microscopia eletrônica
Grande poder de resolução; detalhes da
estrutura celular

Separação de organelas celulares

Estudo celular em Microscopia Óptica

Mono-ocular Binocular Múltiplos observadores

Constituído de: parte mecânica + parte óptica (Lembra da prática?)

Parte Óptica 🡪 3 sistemas de lentes

Condensador 🡪 projeta a luz sobre as células
Objetiva 🡪 recebe o cone de luz, projeta uma imagem aumentada
Ocular 🡪 recebe imagem da objetiva e amplia
Limites de Resolução
Estudo celular em Microscopia Óptica

• Exames de tecido à fresco

• Exame de tecidos mortos ou preservados
• Problemas
– Células transparentes
– Células pequenas e complexas

• Visualização: coloração
Estudo celular em Microscopia Óptica
Exames de tecido à fresco
• Corte fino ou transparente para ser posto na
lâmina
 Estudo celular em Microscopia
Exames de tecido à fresco
• Espalhamento - células de mucosa bucal

azul de metileno
 Estudo celular em Microscopia
Exames de tecido à fresco
• Esfregaço – células sanguíneas
 Estudo celular em Microscopia
Exames de tecido à fresco
• Esmagamento – cromossomos e núcleo em
interfase
 Estudo celular em Microscopia
CORTES HISTOLÓGICOS
• Cortes extremamente finos para permitir a fixação
na lâmina
 Estudo celular em Microscopia
FIXAÇÃO E PREPARAÇÃO DE CORTES
✓ FIXAÇÃO DE TECIDOS

▪ Formol, Glutaraldeído, Misturas fixadoras...

✓ PREPARAÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOS

▪ Cortes de tecido
▪ Desidratação
▪ Diafanização
▪ Infiltração / Impregnação
▪ Cortes em m
▪ Coloração
▪ Montagem
▪ Visualização
 Fixação Desidratação Diafanização Infiltração

Montagem Coloração Microtomia

Fixação - promove a preservação das características
morfológicas e macromoléculas dos tecidos ou
células.

• Função → impedir a autólise ou degradação

bacteriana do material biológico a ser analisado

• Facilitar os processamentos posteriores de

coloração → muitos corantes apresentam maior
afinidade pelo substrato fixado → promover o
enrijecimento dos orgãos e tecidos.

• Aumentar o contraste na microscopia eletrônica

Fixadores → agentes químicos das mais diversas
funções orgânicas;

– Reagem quimicamente com os componentes

celulares, promovendo a sua estabilização.

– Principais componentes celulares que podem ser

preservados → proteínas, ácidos nucléicos,
polissacarídeos e lipídios → os fixadores atuam
sobre estas macromoléculas tornando-as insolúveis.
• Desidratação → retirada lenta de água

• Bateria de álcool com concentrações crescentes: 70%,

80%, 90% e 100% → o tempo vai depender do material
e do material de inclusão.

• A água deve ser toda retirada por não ser missível em

XILOL ou em ÓLEO DE CEDRO → diafanização →
clareamento do material

• Inclusão em parafina → dar maior consistência ao

material.
• Microtomia → corte do material em micrótomo.
 Coloração para Microscopia Óptica
• Corantes básicos ou catiônicos (+) - Liga-se a moléculas com carga (-)
BASOFILIA → a estrutura corada é BASÓFILA
Ex: Azul de Metileno, Azul de Toluidina, Hematoxilina, Orceína,
lugol, Verde-janus B, violeta de genciana
Núcleo → DNA e RNA
Citoplasma → proteínas e carboidratos
• Corantes ácidos ou aniônicos (-) - Liga-se a moléculas com carga (+)
ACIDOFILIA → a estrutura corada é ACIDÓFILA
Ex: Eosina, Ácido Periódico Schiff (PAS), ácido ósmico
Citoplasma e núcleo → proteínas com carga (+)
NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não
revelam acidofilia nem basofilia. Ex: Vermelho neutro.
 Coloração para Microscopia Óptica

Quanto ao papel fisiológico:

VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Ex: Verde-janus B, azul de
metileno, vermelho neutro, Sudan III.

NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol,

vermelho escarlate, violeta de genciana.

Quanto às propriedades tintoriais:

ORTOCROMÁTICOS - Conferem a célula a mesma cor que apresentam in
vitro. Exemplos: Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro.

METACROMÁTICOS - Dão a célula coloração diferente da que apresentam

in vitro. Exemplos: Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.
 Coloração para Microscopia de
Fluorescência

Envolve a aplicação de técnicas

citoquímicas
Reação com anticorpos ou
corantes fluorescentes
Radiação ultravioleta como
equivalente a fonte de luz em
microscopia óptica
 Microscópio Eletrônico

Potencial de aumento muito

maior que o óptico

Inventado em 1932 e vem

sendo aperfeiçoado desde
então
Intervalo de aumento 🡪
1.000x a 200.000x.

Poder de resolução = 1nm

(200x maior que o
MO)
Microscópio Eletrônico

• Feixes de elétrons ao invés de luz

(óptica)

No microscópio eletrônico não há

lentes de cristal e sim bobinas,
chamadas de lentes
eletromagnéticas;

• As lentes eletromagnéticas
ampliam a imagem gerada pela
passagem do feixe de elétrons no
material e projetam-na sobre uma
tela, onde é formada a imagem
Obtenção dos cortes para M.E.

+ solução de sais de
urânio e chumbo
• Não é possível observar material vivo neste tipo de
microscópio;

• O material a ser estudado passa por um complexo

processo:
– Desidratação
– Fixação
– Inclusão em resinas especiais (muito duras)
– Cortes ultrafinos obtidos através das navalhas de vidro-
ultramicrótomo;
A imagem do objeto é formada simultaneamente à passagem
do feixe de luz através dele.

Bastante difundido no estudo de materiais biológicos, permite

definição de imagens intracelulares, permitindo estudos de
morfologia celular, aspectos gerais das organelas e também da
interação de parasitas com células.

•Tipos de microscópios eletrônicos:

–Transmissão – MET - usado para a observação de cortes

ultrafinos;

–Varredura – MEV - capaz de produzir imagens de alta

ampliação usado para a observação de superfícies;
 Fagocitos
e

Célula animal
Célula vegetal
 Mitocôndrias

Cloroplasto

Complexo de Golgi
 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Um feixe de elétrons
bombardeia a superfície do
material “varrendo-a”;
então, elétrons secundários
ou refletidos são utilizados
para obter imagens
tridimensionais.

Capaz de produzir imagens

de alta ampliação e
resolução aumentos 10x a
400.000x com grande
profundidade de foco
Poder de resolução de
10nm.
 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

As imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter

virtual;

O que é visualizado no monitor do aparelho é a

transcodificação da energia emitida pelos elétrons, ao
contrário da radiação de luz

A topografia de objetos sólidos pode ser examinada com

grande facilidade, as micrografias têm aspecto
tridimensional;
Ataque de leveduras à Salmonella
Diferentes formas de grãos de pólen
MEV MET
 SEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARES

❖ CENTRIFUGAÇÃO

▪Permite isolar organelas de homogeneizados celulares,

para análises químicas, físicas e biológicas;

▪ O isolamento de uma organela depende de:

- seu coeficiente de sedimentação;
- densidade e viscosidade da solução.

▪ Centrifugação Fracionada;

▪ Centrifugação Contra Gradiente.

Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um
meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue,
suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).

Vários métodos são

por ultra-som com possíveis para transformar
Material na detergente células, órgãos, tecidos em
fonte um homogenado, ou extrato
bruto, como mostr a a figura.
células
Homoge neização
(para rom per tecidos e células)

tecidos

Homogenado
Material
ou
Extrato bruto de
por pressão liquefação partida
(prensa francesa) (Potter)
Centrifugação Fracionada
Centrifugação Contra Gradiente
 Cromatografia
• Separação de macromoléculas, como proteínas
e ácidos nucléicos
• “Filtragem” de um macerado celular em uma
matriz porosa, por meio da interação das
macromoléculas com a matriz
– Interação de Troca iônica: dependente de cargas
– Interação hidrofóbica
– Filtração em gel: dependente do tamanho e
forma
– Interação por afinidade: enzima-substrato ou
antigeno-anticorpo.
Cromatografia

Matriz

Tubos
coletores
▪ Cromatografia de Troca Iônica

-A matriz da coluna cromatográfica é

carregada + OU –

- Proteínas ligam ao suporte

por interação de carga.
 ▪ Cromatografia de Interação Hidrofóbica

-A matriz da
cromatográfic é coluna por
a
partículas com
composta
superfície
hidrofóbica
;

- Proteínas hidrofóbica
interagem com s suporte
o
retardam sua passagem. e
Cromatografia de Filtração em Gel

-A matriz da coluna
cromatográfica é composta por
partículas porosas, atuando
como peneira para
uma
passagem de proteínas;
a
Cromatografia de Afinidade

- A matriz da coluna
cromatográfica é composta por
antígenos (ou substratos para
enzimas) ligados;

- Proteínas ligam ao suporte

por bioafinidade
e especificidade.
 Eletroforese
Determina o tamanho das
proteínas;
Identifica fragmentosde
diferente tamanhos
s
DNA de
clivado ou sintetizado.

Separação das
macromoléculas por carga
(+ ou -) e tamanho (do
maior para o menor)
 Proteínas de diferentes
tamanhos e cargas

Fragmentos de DNA de
diferentes tamanhos
- Hibridização ex situ
Resumindo... Existem diversas formas
de se explorar a célula:
Ponto de vista morfológico: Microscopia
óptica fluorescência
eletrônica (transmissão e varredura)

Ponto de vista das organelas e seus constituintes:

Centrifugação: isolamento de organelas
fracionada e com gradiente
Cromatografia: isolamento de macromoléculas
Troca iônica Interação hidrofóbica
Filtração em gel Afinidade
Eletroforese: análise das macromoléculas