Biologia Celular

Métodos de Estudo da Célula

As células são as unidades estruturais dos seres vivos.
As células são estruturas microscópicas de grande
complexidade e variabilidade.

Célula animal

Célula vegetal
 Eubactérias Archea Células fossilizadas de
Glóbulos vermelhos
dinossauros

Algas verdes Neurônio Célula de planta

Células intestinais humanas
 Eventos marcantes no estudo das células

1. Microscopia ótica (início do século XIX)

2. Microscopia eletrônica (década de 30-40)
3. Fracionamento subcelular (correlação entre
estrutura celular e atividade bioquímica)
4. Biologia celular e molecular (a partir de 1970)
Unidade de comprimento:

1 mm = 1000 micrometros (µm) (10-3m)

1 µm = 1000 nanometros (nm) (10-6m)
1 nm = 10 Angstrons (A) (10-9m)

Árvore: 30m
Homem: 1.5-2m
Diâmetro de alga gigante: 5mm
Ameba: 100µm
Maioria das células eucarióticas: 10-50µm
Maioria das células procarióticas: 1-5µm
Maiores virus: 300nm
Menor virus: 20nm
Amostragem de objetos numa escala logarítmica

(a) Dupla-hélice do DNA = 2 nm (b) embrião humano três dias após a fertilização = 200 m

(c) Pêlo de uma aranha = ~ 15 mm (d) pinguins imperiais = 1 m

 Purificação e análise de estruturas subcelulares

A maior parte dos estudos sobre a função e estrutura celular

requer amostras de um tipo celular ou organela.
Entretanto, a maior parte dos tecidos é formada por diversos
tipos celulares distintos. Desta forma, há a necessidade de
se utilizar diferentes metodologias e abordagens no estudo
das células.
Amplitude do tamanho de objetos visualizados
por diferentes técnicas microscópicas
MICROSCOPIA DE LUZ
Aparelhos para visualizar organismos e estruturas:

Microscópio de Luz (ML): Capacidade de aumento e poder de

resolução (nitidez).

- Poder de resolução = capacidade de visualização da distância entre

duas partículas.
- Limite de resolução = menor distância entre duas partículas que se
pode visualizar com nitidez. Olho = 0.1mm; ML = 0.2 µm.
- O aumento máximo do ML é de 1000 a 1200x.
- É composto de fonte de luz, condensador, platina (onde coloca a
lâmina e canhão (lente objetiva [10x, 45x, 100x] e lente ocular).
- O material para observação no ML deve ter transparência e
contraste.
Microscópio óptico

ocular

corpo

canhão braço

objetivas

mesa parafuso
macrométrico
condensador parafuso
controle do diafragma micrométrico
ajuste da mesa
base com fonte de luz
nível do diafragma

controle de
intensidade
de luz 11
 MÉTODOS DE CORTE
(FIXAÇÃO - COLORAÇÃO)
Tecidos usados na microscopia ótica são normalmente fixados (tratamento que visa
proteger as interações proteína-proteína e proteína-ácidos nucléicos, a fim de
tornar as moléculas estáveis e insolúveis ), incluídos num suporte e cortados em
finas seções (50-100 nm) ou (0,5-50 ) para uso no microscópio ótico ou eletrônico,
respectivamente.
Métodos de microscopia de luz:
1. Células fixadas:
1.1. Métodos que utilizam cortes.
a. Fixação é feita com componentes que matam a célula e conservam
sua estrutura. Formol, ác. acético e alcool são bons fixadores.
b. Inclusão em parafina (ou resina). Inicialmente é preciso desidratar o
material com um gradiente de alcool: 70%, 95% e 100%. Depois deixa
em xilol (solvente da parafina) e depois na parafina (inclusão) que
resfriará com o tecido no seu interior. Pode-se utilizar corantes ou não
no tecido antes de formar o bloco para corte.
c. Cortes. O bloco é então cortado no micrótomo, regulando-se a
espessura do corte. A lâmina pode então ser montada.
d. Coloração. Inicialmente a parafina é removida com xilol e o tecido
cortado é hidratado com um gradiente de alcool, 100%, 95%, 70% e
água.
-Corantes: Hematoxilina ferrica para o núcleo (preto); Eosina
para o citoplasma (vermelho); Orceína para cromossomos (vermelho);
Carmin para cromossomos (vermelho).
e. Preparar lâmina permanente. Utiliza-se uma resina chamada
bálsamo do Canadá. Uma lâmina permanente pode durar por um longo
tempo se bem corada (20-30 anos).
 MÉTODOS DE CORTE
(FIXAÇÃO - COLORAÇÃO)
1.2. Observação de células intactas.

Servem para contagem de cromossomos e estudo de divisão celular,

por exemplo.

Células isoladas. Esfregaço de células de sangue; esmagamento de

ponta de raiz, por exemplo.

Procede-se com a fixação, hidrólise em HCl 1N (para decompor

paredes celulares) e coloração.
Material da UFRGS
Obtido da Internet
MICROSCOPIA DE LUZ
 Microscopia Eletrônica
Os princípios básicos da microscopia eletrônica são similares à microscopia
ótica; a diferença principal baseia-se na utilização de lentes eletromagnéticas
(M.E.) em relação às lentes óticas (M.O.).

TEM = Microscopia Eletrônica de Transmissão

SEM = Microscopia Eletrônica de Varredura

Microscópio eletrônico (ME) de transmissão:

Tem grande aumento (100.000x). Utiliza um feixe de

elétrons de 0.004 nm. Isto permite um limite de resolução
de 0.1 a 0.5 nm. O ME tem lentes que funcionam como
espirais magnéticas. São utilizadas no lugar de lâminas de
vidro, telinhas de metal. Existe uma projetiva e uma
objetiva.

Microscópio eletrônico de varredura:

Tem aumento menor que o de transmissão, contudo a

imagem é formada por elétrons que são refletidos do
objeto que esta sendo examinado, portanto o feixe de
elétrons não atravessa o tecido como no ME de
transmissão. Permite, portanto, a observação de
superfícies celulares (células soltas, bactérias, virus).
 Núcleo de Apoio à Pesquisa/
Microscopia Eletrônica Aplicada à Pesquisa Agropecuária

MEV

http://www.esalq.usp.br/napmepa/
Prof. Dr. Elliot Watanabe
Kitajima

MET
 MICROSCOPIA ELETRÔNICA
VARREDURA

Glóbulos vermelhos Células do epitélio intestinal

MICROSCOPIA ELETRÔNICA
TRANSMISSÃO

Retículo endoplasmático

Mitocôndria

Peroxissoma

Lisossoma
 MICROSCOPIA ELETRÔNICA VARREDURA

Raízes de Rabanete: a – controle; b,c,d – acúmulo de resíduos

MICROSCOPIA ELETRÔNICA VARREDURA

Folhas de Rabanete
Métodos de estudo de ME:
a. Preparação do material. Deve ser ultra fino sendo que o corte é feito
em um ultramicrótomo.
b. Métodos que utilizam cortes.
b1. Fixação: utilizam-se agentes que precipitam as moléculas e as
mantém insolúveis para que o corte seja possível sem estragar o
material. Pode-se usar Glutaraldeido que liga-se covalentemente as
proteínas e as mantém unidas. O tetróxido de ósmio liga-se as
camadas de lipídios.
b2. Inclusão: Não se utiliza parafina mas sim um plástico polimerizado
(Araldite metacrilato).
b3. Cortes: Ultramicrótomo. Utiliza-se navalha de diamante ou de vidro
mas não de metal. Os cortes podem ter várias orientações como
transversal, longitudinal e obliquo. Desta forma pode-se fazer uma
reconstrução tridimencional do objeto.
b4. Montagem: é feita sobre a tela.
b5. Coloração: Utiliza-se sais de metais pesados (urânio, chumbo,
ósmio, ouro, platina) sendo que o metal fica impregnado nas estruturas
tornando o material eletrodenso.
b6. Análise. São feitas fotografias que são utilizadas na reconstrução.
 PREPARAÇÃO DO MATERIAL
(FIXAÇÃO - CORTE - COLORAÇÃO)

Suporte do Cortes retirados

micrótomo d’água com tela e
secos
Tecido incluído
em plástico

Aresta cortante Fitas de corte

flutuando em água

Faca de Aspectos dos

vidro cortes, prontos para
serem corados
Métodos especiais de ME.

a. Métodos que não utilizam cortes.

a.1. Sombreamento: observação de pequenas partículas como virus,

bactérias e macromoléculas (DNA, proteínas). O material seco é
colocado sobre uma película de plástico e pulverizado em um
determinado ângulo com metal pesado.

a.2. Coloração negativa: Obtém-se uma imagem negativa após cobrir o

material com um sal de metal pesado seguido de evaporação.
a. Microscopia de contraste de fase: Tem uma objetiva e condensador
de contraste de fase. Células vivas tem pequeno contraste entre
citoplasma e organelas. Neste microscópio aumenta-se as diferenças
entre os índices de refração das organelas.

b. Métodos citoquímicos: servem para localizar moléculas dentro da

célula ou locais de síntese de macromoléculas.
ex: DNA: núcleo, cloroplasto e mitocondria.
RNA: sintetizado no núcleo e vai para o citoplasma.
Plantas: células que sintetizam DNA (estão se dividindo,
mitose).

b.1. Autoradiografia: utilização de isótopos radioativos.

ex: estudo da replicação do DNA em células meristemáticas. Para isto,
plântulas são imersas em uma solução contendo timidina tritiada
(radioativo, emite radiação beta) que é absorvida e incorporada no
DNA que esta sendo sintetizado. Prepara-se uma lâmina da raiz
intacta e recobre com um filme de fotografia no escuro, desta forma a
radiação que deverá estar nos cromossomos irá sensibilizar o filme
que é então revelado.
b.2. Microscopia de fluorescência:

A fluorescência é a capacidade de absorver luz em um comprimento

de onda e emitir em outro (maior). É um efeito luminoso. Pode-se
aplicar um corante fluorescente no material e analisar em um
microscópio de fluorescência.

Ex: Localizar uma proteína na célula por imunocitoquímica. Para isto,

tratamos a célula com anticorpos específicos (marcados com um
corante fluorescente) para a proteína que queremos. O anticorpo liga-
se a proteína.
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
(TÉCNICAS CITOQUÍMICAS)
 IMUNOCITOQUÍMICA

Antígeno
celular

Anticorpo

Antigamaglobulina
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
(TÉCNICAS CITOQUÍMICAS)
c. Métodos bioquímicos:

Os métodos de microscopia são classificados como

métodos citológicos que mantém a célula praticamente
intacta. Os métodos bioquímicos estudam os componentes
da célula, destruindo-se as células.
c.1. Fracionamento celular:

Divide-se a célula em seus componentes. Para isto é necessário o rompimento da célula

por um método mecânico, mas que mantenha os componentes intactos.
Faz-se então uma centrifugação em gradiente de sacarose ou diferencial.

A velocidade de sedimentação depende da densidade, tamanho e morfologia das

partículas. Esta velocidade é medida em força da gravidade (g) ou em rpm.

No caso da centrifugação diferencial, utiliza-se por exemplo uma rotação baixa para
isolar o núcleo e grandes fragmentos de membranas. O sobrenadante é transferido para
outro tubo e uma rotação maior é utilizada, precipitando peroxissomos, mitocondrias,
lisossomos e outros.

O sobrenadante é novamente centrifugado em um outro tubo com velocidade ainda

maior e assim por diante. Mas, se queremos separar a mitocondria por exemplo, este
método não seria suficiente, pois teríamos também outras organelas junto as
mitocondrias.

Podemos utilizar o gradiente de sacarose neste caso. Este gradiente é formado em um

tubo de centrifuga de forma que exista um gradiente de concentração de sacarose ao
longo do tubo, sendo mais concentrado no fundo do tubo. Coloca-se então a amostra
dissolvida com mitocondrias, lisossomos, etc no topo do tubo e centrifuga-se novamente.
Retira-se então com uma seringa as frações. Este método serve também para
macromoléculas.
Centrifugação Diferencial
CENTRIFUGAÇÃO
DIFERENCIAL
CENTRIFUGAÇÃO DIFERENCIAL
CENTRIFUGAÇÃO COM GRADIENTE

ANTES DEPOIS
Centrifugação via Gradiente de
Densidades
c.2. Separação de moléculas:

Suponha que eu isolei as mitocondrias pelo método acima e agora eu

quero isolar as proteínas das mitocondrias.

Existem inúmeros métodos para análise das macromoléculas da

células e outros peptídeos menores.

Destacam-se hoje as técnicas denominadas diferencialmente pelo tipo

de componente bioquímico que se analisa: As análises de enzimologia,
biologia molecular são chave para entendimento das macromoléculas
mas dos fenômenos fisiológicos e bioquímicos da célula.

De forma ampla, deve-se destacar a Genômica, Proteômica,

Metabolômica, etc....

Uma das técnicas importantes amplamente utilizadas é a eletroforese.

Este método permite grande resolução e é baseado na separação das
macromoléculas de acordo com carga elétrica e tamanho.
Cromatografia de Filtração em Gel
Cromatografia em
Camada Delgada
(TLC) de
Aminoácidos
Eletroforese de Proteínas – Equipamento
Gel de proteína de reserva de sorgo - Corante: Prata
Géis de Eletroforese – Coloração para Atividade Enzimática

A B C D E F G H I J K L

Gel Não-Desnaturante: Estearase e Superóxido Dismutase

 SDS

Géis de Eletroforese
Coloração para
Atividade Enzimática
(CAT e SOD) CAT

e para
Proteína Solúvel Total
(SDS)

SOD
Géis de Eletroforese
Coloração para
Atividade Enzimática
(AK)
Eletroforese de DNA