CENTRO UNIVERSITÁRIO GERALDO DI BIASE

FUNDAÇÃO EDUCACIONAL ROSEMAR PIMENTEL

CURSO DE NUTRIÇÃO

Métodos de Estudos da Célula

Willian Brayan de Andrade Carvalho

2023122046

Volta Redonda, 2023

❖ Sumário:

♦ Demonstração do conteúdo do trabalho (página 3).

♦ Corpo do trabalho (páginas 4 à 19):
 microscópio de luz e microscópio eletrônico de transmissão (páginas 4 à
10);
 Técnicas de preparação e execução de estudo (páginas 10 à 19)
♦ Fontes e Referências Bibliográficas (20).
 → Introdução:

Os métodos de estudo da biologia celular baseiam-se principalmente no

estudo das estruturas e processos celulares por microscópio de luz (ML) e
microscópio eletrônico (ME), permitindo identificar a célula como componente
dinâmico e participante do metabolismo do corpo. Basicamente, esses estudos
utilizam placas com colorações histológicas e histoquímicas como ferramentas
para microscopia de luz e telas de cobre com células opostas a metais pesados
em estudos microscópicos eletrônicos (transmissão, varredura), cujos
conceitos são aqui apresentados de forma geral.
 → Desenvolvimento:
▪ Microscópio de Luz e Microscópio Eletrônico de Transmissão
Na imagem abaixo, as características dos dois primeiros quadros são
mostradas a olho nu, a resolução do microscópio óptico (ou de luz) se estende
até o quarto quadro e a resolução do microscópio eletrônico se estende até o
sétimo e oitavo quadros. Nela também mostra o tamanho de diferentes
estruturas celulares e subcelulares e as diferenças de tamanho que podem ser
vistas com diferentes tipos de microscópios.

Uma escala entre células vivas e átomos: Cada diagrama nesta figura mostra
uma imagem ampliada em 10 vezes a progressão imaginária do polegar e, em
seguida, as células da pele através do ribossomo até o aglomerado nuclear
fazem parte do mesmo número de moléculas de proteína em nosso corpo.

O detalhe atômico em macromoléculas, como mostrado nos dois últimos

quadros, geralmente está além do poder do microscópio eletrônico. Uma célula
animal típica tem 10-20 µm de diâmetro, que é cerca de 1/5 do tamanho visível
a olho nu. O limite do microscópio de luz é o comprimento de onda da luz
visível, que está entre 0, -0,7 µm (violeta ao vermelho). Assim sendo, as
mitocôndrias e as bactérias, que têm aproximadamente 200–500 nm (0,2–0,5
µm), são os últimos objetos vistos através de um microscópio de luz.
Atualmente as unidades de medida usadas em biologia celular e histologia são
micrômetro e nanômetro.

Os tamanhos das células e seus componentes são dados em escala

logarítmica, indicando a amplitude de objetos facilmente resolvidos a olho nu e
microscópios de luz e elétrons. µm (micrômetro) = 10 elevado a-6 m; nm
(nanômetro) = 10 elevado a -9 m; Å (unidade Ångstrôm) = 10 elevado -10 m.
Essas são as unidades de comprimento normalmente usadas na microscopia.
 Os microscópios são dispositivos nos quais as lentes de vidro são
combinadas para que uma imagem ampliada e detalhada de células, tecidos e
órgãos possa ser reproduzida para o olho humano. O conjunto de lentes é
formado pelas objetivas e oculares. A lente objetiva, a primeira lente e a lente
mais próxima do objeto, daí o nome, incide a luz filtrada no condensador e
reflete a imagem real, invertida e ampliada da estrutura. Uma ocular é usada
para ampliar a imagem projetada pela lente de modo que chame a atenção do
observador.
A ampliação total do objeto observado no ML é calculada multiplicando os
valores de ampliação da objetiva e da ocular. Com isso:

O limite de separação no qual dois objetos ainda podem ser vistos

separadamente - o limite de resolução - depende tanto do comprimento de
onda da luz quanto da abertura numérica do sistema de lentes usado. Este
último número é uma medida da largura da abertura microscópica dividida por
sua distância; quanto maior a abertura do microscópio, mais claro o objeto
pode ser visto. Nas melhores condições, com luz violeta (comprimento de onda
= 0,4 µm) e abertura numérica de 1,4µm, a resolução de um microscópio óptico
pode teoricamente chegar a pouco menos de 0,2 µm. Essa resolução foi
alcançada pelos fabricantes de microscópios no final do século 19 e raramente
é igualada na indústria moderna de microscópios. Embora seja possível
ampliar uma imagem o quanto quisermos - por exemplo, projetando-a em uma
tela - nunca é possível distinguir dois objetos separados por menos de 0,2 µm
com um microscópio óptico; eles aparecem como um objeto. Observe a
diferença entre resolução e detecção discutida anteriormente.

Portanto, o limite de diferença onde dois objetos ainda podem ser vistos como
separados é chamado de limite de resolução, depende do comprimento de
onda da luz e da abertura numérica do sistema de lentes. Quando a luz passa
por uma célula viva, a fase da onda de luz muda de acordo com o índice de
refração da célula: uma parte relativamente espessa ou densa da célula, como
o núcleo, retarda a passagem da luz por ela. Como resultado, a fase da luz é
alterada em relação à luz que passou pela região mais fina do citoplasma
adjacente. O microscópio de contraste de fase e o mais sofisticado microscópio
de contraste de interferência diferencial exploram os efeitos de interferência
produzidos pela recombinação de duas séries de ondas para criar uma imagem
da estrutura da célula. Ambos os tipos de microscopia de luz são amplamente
utilizados para a imagem de células vivas. Uma maneira mais fácil de visualizar
algumas dessas propriedades de uma célula viva é observar a luz espalhada
por seus vários componentes.
 Em um microscópio de campo escuro, os raios de luz são direcionados
lateralmente, de modo que apenas a luz espalhada passe pela lente do
microscópio. Como resultado, a célula aparece como um objeto brilhante em
um fundo escuro. Com um microscópio de campo claro padrão, a luz que
passa por uma célula cultivada forma diretamente uma imagem.

Comparando o mesmo fibroblasto com 4 microscópios de luz diferentes: em (A)

Microscópio de campo claro - a luz passa através da célula e forma uma
imagem diretamente; em (B) microscópio de contraste de fase; em (C)
microscópio de contraste de interferência diferencial; em (D) microscópio de
campo escuro.

A relação entre o limite de resolução e o comprimento de onda da radiação

luminosa se aplica a todos os tipos de radiação, seja um feixe de luz em ML ou
um feixe de elétrons em ME. Para elétrons, por outro lado, o limite de resolução
pode ser muito pequeno. O comprimento de onda do elétron diminui com o
aumento da velocidade. Em um microscópio eletrônico com uma voltagem
acelerada de 100.000 V, o comprimento de onda dos elétrons é 0,004 nm. Em
teoria, tal microscópio deveria ter uma resolução de aproximadamente 0,002
nm, que é 100.000 vezes maior que a de um microscópio óptico. No entanto,
como as aberrações das lentes eletrônicas são mais difíceis de corrigir do que
as aberrações introduzidas por uma lente de vidro, a maioria dos microscópios
eletrônicos modernos tem uma resolução de 0,1 nm (1 Å) nas melhores
condições. Isso ocorre porque apenas o centro da lente eletrônica pode ser
usado e a abertura numérica efetiva é pequena. Além disso, problemas com a
preparação da amostra, contraste e dano por radiação geralmente limitavam a
resolução efetiva normal de materiais biológicos a 1 nm (10 Å). No entanto,
esse valor é cerca de 200 vezes melhor que a resolução de um microscópio de
luz. Nos últimos anos, o desempenho dos microscópios eletrônicos foi
aprimorado pelo desenvolvimento de fontes de luz eletrônica chamadas de
canhões de emissão de campo. Essas fontes muito brilhantes e confiáveis
podem melhorar muito a resolução alcançada. Em geral, um microscópio
eletrônico de transmissão (TEM) é semelhante a um microscópio óptico. A
fonte de luz é um filamento ou cátodo que emite elétrons do topo de uma
coluna cilíndrica com cerca de 2 m de altura. Como os elétrons são espalhados
por colisões com moléculas de ar, o ar deve primeiro ser bombeado para fora
da coluna para criar um vácuo. Os elétrons são então acelerados pelo
filamento através de um ânodo próximo e através de um pequeno orifício para
formar um jato de elétrons que viaja ao longo da coluna. Bobinas magnéticas
colocadas em certos intervalos ao longo da coluna focam o feixe de elétrons
como lentes de vidro focam a luz em um microscópio óptico. A amostra é
colocada no vácuo através de uma câmara de pressão com um feixe de
elétrons. Assim como na microscopia de luz, a amostra geralmente é corada -
neste caso, com um material elétron-denso. Alguns dos elétrons que passam
pela amostra são espalhados por estruturas pintadas com um material elétron-
denso; o resto é focado para formar uma imagem semelhante ao processo de
formação de imagem em um microscópio de luz.

A imagem pode ser visualizada em uma tela fluorescente ou gravada em uma

placa fotográfica ou com uma câmera digital de alta definição. Quando os
elétrons dispersos são rapidamente desviados, regiões densas da amostra são
destacadas como áreas de fluxo de elétrons reduzido que aparecem escuras.

▪ Técnicas de Preparação e Execução de Estudo

Ao preparar o material a ser examinado ao microscópio, geralmente devem ser

seguidas as seguintes etapas de preparação:

▫ Fixação.
▫ Inclusão e Etapas Precedentes.
▫ Microtomia.
▫ Coloração (ML)/ Contrastação (ME).
 ▫ Fixação:
A fixação é uma etapa histotécnica que visa garantir que as estruturas
morfológicas das células e tecidos sejam preservadas como seriam no animal
"em vida", tornando a célula ainda permeável ao corante, estabilizando sua
ligação com as macromoléculas. Para isso, são utilizados fixadores químicos e
físicos, dos quais as misturas químicas mais utilizadas. Essas combinações
usam fixadores simples como formaldeído, ácido acético, álcool, eles podem
ser compatíveis e contribuir para a fixação total do tecido. Exemplos são os
líquidos de Bouin (forma de aldeído, ácido acético, ácido pícrico), Hell y ou
Zenker-Formol (dicloreto de mercúrio, dicromato de potássio), etc. Os mais
comuns para ME são glutaraldeído e tetróxido de ósmio.

▫ Inclusão e Etapas Precedentes:

Os próximos passos são penetrar os endurecedores nos pedaços dos órgãos

para fazer incisões bem finas. Estas são etapas estritamente sequenciais e
obrigatórias para a maioria das técnicas, e uma etapa mal executada resultará
em material de análise de baixa qualidade.
− Desidratação:
O objetivo é remover um pouco de água, pois os revestimentos são insolúveis
em água. Esta etapa é realizada usando álcoois graduados em tempos
apropriados para o dispositivo e material. Acetona ou óxido de propileno
também são usados para ME.

− Diafanização:
O objetivo é retirar o álcool da peça (pois as aplicações são pouco solúveis
em álcool) e deixá-la transparente. São utilizadas substâncias que se
dissolvem no álcool e são capazes de removê-lo, por exemplo, toluol, xilol,
benzol, etc
− Inclusão:
A inclusão geralmente é feita em parafina histológica e resinas plásticas,
(metacrilato) para ML e resina epon para ME. As resinas dão resultados mais
adequados.

▫ Microtomia.
 Na etapa de microtomia, os cortes são feitos os mais finos possíveis, o que
permite que sejam observados com um microscópio de luz ou eletrônico. É
utilizado um micrótomo, aparelho próprio para isso, cujo ajuste em micrômetros
(µm) e nanômetros (nm) (ME - ultramicrótomo) permite cortar a espessura
desejada. Após esta etapa, as peças são recolhidas em bandejas de vidro para
LM ou telas de cobre para ME.
  Planos de Corte:

Para entender a estrutura de um órgão, é necessário estudar seções

transversais em diferentes níveis de visualização e avaliar adequadamente. A
Figura 3 mostra alguns planos de observação possíveis para a célula.
Observação: os planos de corte transversais 2 e 3, e oblíquo expõem no
esquema, o que seria o "núcleo" da célula.
 ▫ Coloração (Microscopia óptica ou de luz):
− Métodos histológicos da microscopia de luz:

A maioria das estruturas celulares e teciduais são transparentes, coloridas e

possuem índice de refração muito próximo, dificultando sua observação.
Portanto, é necessário o uso de colorações histológicas que mostrem e
diferenciem tais estruturas. Basicamente, esses métodos visam combinar a
natureza básica ou ácida do corante e são usados em conjunto com a natureza
do material que está sendo testado. Desta forma, forma-se um grupo químico
correspondente a uma cor ou a um grupo cromóforo. Portanto, moléculas
ácidas como DNA e RNA são acidófilas devido à sua afinidade por corantes
ácidos. Por exemplo, as seções podem ser coradas com corantes orgânicos
que tenham certa afinidade por certos componentes intracelulares. Por
exemplo, a coloração hematoxilina tem afinidade por moléculas carregadas
negativamente e mostra a distribuição de DNA, RNA e proteínas ácidas na
célula.

− Métodos Histoquímicos:

Estes são os processos de coloração que dão especificidade porque os grupos

e radicais químicos formam as estruturas reveladoras, de modo que as
colorações histoquímicas os mostram especificamente. Ex.: hidratos de
carbono, ácidos nucleicos, aminoácidos, íons, lípidos, etc. Localização de
ácidos nucléicos: o método Feulgen Localização de hidratos de carbono:
técnica PAS (Periodic Acid-Schiff).
 Em (A) a seção celular dos ductos coletores renais foi corada com uma
combinação de corantes, hematoxilina e eosina, comumente usados em
histologia. Cada dueto consiste em células compactadas (com núcleos corados
de vermelho) formando um anel. O anel é circundado por uma matriz
extracelular corada de roxo. Em (B) a seção de raiz de uma planta jovem é
corada com dois corantes, safranina e fastgreen. O fastgreen mancha a parede
celular da celulose, enquanto a safranina cora as paredes celulares do xilema
lignificado de rosa. A hibridização in situ baseia-se nos princípios da hibridação
de ácidos nucleicos descritos acima. Normalmente, os tecidos são
cuidadosamente fixados para que seu RNA seja complementar. Dessa forma,
os padrões diferenciais de expressão gênica podem ser observados nos
tecidos e a localização de RNAs específicos nas células pode ser determinada.

As moléculas fluorescentes absorvem a luz em um comprimento de onda e a

emitem em um comprimento de onda maior. Se você iluminar tal composto em
seu comprimento de onda de absorção e depois olhá-lo através de um filtro que
deixa passar apenas a luz do comprimento de onda emitido, ele brilha contra
um fundo escuro e, sob um microscópio de fluorescência, você pode até ver a
coloração das células.
 Este microscópio é semelhante a um microscópio óptico comum, exceto que a
luz usada para iluminação, que vem de uma fonte muito poderosa, passa por
dois conjuntos de filtros: um para filtrar a luz antes que ela chegue à amostra e
outro para filtrar a luz obtida a partir da amostra. O primeiro filtro permite a
passagem apenas dos comprimentos de onda que excitam um determinado
corante fluorescente, enquanto o segundo filtro bloqueia essa luz, permitindo a
passagem apenas dos comprimentos de onda que emitem quando o corante
fluoresce. A microscopia de fluorescência é mais frequentemente usada para
detectar proteínas específicas ou outras moléculas em células e tecidos. Uma
técnica muito eficaz e amplamente utilizada é a ligação de corantes
fluorescentes a moléculas de anticorpos, que então atuam como reagentes
para colorações específicas e versáteis. Eles se ligam seletivamente a certas
macromoléculas que reconhecem das células ou da matriz extracelular. Dois
corantes fluorescentes comumente usados para esse fim são a fluoresceína,
que emite uma forte fluorescência verde sob luz azul, e a rodamina, que excita
a fluorescência vermelha sob luz amarelo-esverdeada. ligando um anticorpo à
fluorescência e o outro à rodamina, é possível comparar as distribuições de
diferentes moléculas na mesma célula; as duas moléculas são visualizadas
separadamente ao microscópio e dois conjuntos de filtros são trocados, cada
um específico para cada corante. Três corantes fluorescentes podem ser
usados da mesma maneira para distinguir entre três tipos de moléculas em
uma única célula. Vários corantes fluorescentes mais recentes, como CY3,
CY5 e Alexa, foram desenvolvidos especificamente para microscopia de
fluorescência. Esses fluorocromos orgânicos têm algumas desvantagens. Eles
são excitados apenas pela luz de um determinado comprimento de onda
diferente e, além disso, desaparecem muito mais rápido quando
constantemente iluminados.
 Na imagem acima é identificado um microscópio com várias sondas
fluorescentes. Nesta micrografia sintética de uma célula em mitose, três
comprimentos de onda fluorescentes diferentes foram usados para corar três
componentes celulares diferentes. Os microtúbulos do fuso são corados com
um anticorpo fluorescente verde, os centrômeros com um anticorpo
fluorescente vermelho e o DNA cromossômico condensado é corado com o
corante fluorescente azul DAP I. Uma molécula marcadora, como um corante
fluorescente, pode se ligar diretamente ao anticorpo usado. para detecção
específica - anticorpo primário. Um sinal mais forte é obtido quando um
anticorpo primário não marcado é usado e então detectado com uma matriz de
anticorpos secundários marcados ligados. Esse processo é chamado de
imunocitoquímica indireta.

▫ Contrastação (microscopia eletrônica):

Na microscopia eletrônica, a amostra é exposta a alto vácuo, o tecido vivo é

morto e geralmente preservado por fixação - primeiro com glutaraldeído, que
faz com que as moléculas de proteína se reticulem covalentemente com seus
vizinhos e, em seguida, com tetróxido de ósmio, que se liga e estabiliza . . .
bicamadas lipídicas e proteínas. Devido à transmissão muito baixa de elétrons,
os tecidos fixados geralmente precisam ser cortados em seções muito finas
(espessura de 50-100 nm, aproximadamente 1/200 da espessura de uma única
célula) antes da imagem.
 Isso é obtido secando a amostra e impregnando-a com uma resina
monomérica para formar um bloco de plástico sólido; o bloco é cortado com um
vidro especial ou lâmina de diamante usando um micrótomo especial. Essas
seções finas, que não contêm água ou outros solventes voláteis, são colocadas
em uma pequena grade circular de metal para exame microscópico. Um
microscópio eletrônico de varredura (MEV) fornece uma imagem direta da
estrutura tridimensional da superfície da amostra. Para torná-los visíveis, eles
geralmente são impregnados (antes ou depois do corte) com sais de metais
pesados, como urânio e chumbo. Dois agentes de contraste são mais
comumente usados em microscopia eletrônica: acetato de uranila e citrato de
chumbo. grau de saturação ou "coloração"; juntamente com esses sais, revela
diferentes componentes celulares com diferentes contrastes. Por exemplo, os
lipídios tendem a se corar mais fortemente após a osmiofixação, revelando a
localização das membranas celulares.

Em (A) a Microscopia eletrônica mostrando uma área de distribuição de

microtúbulos e vários outros filamentos. Em (B) o mesmo local da figura
anterior corada com anticorpos fluorescente contra a tubulina.
 Essa seção fina é de uma célula de levedura congelada rapidamente, com o
gelo vítreo substituído por solventes orgânicos e, em seguida, resina plástica.
O núcleo, mitocôndrias, parede celular, complexo de Golgi e ribossomos
podem ser visualizados em um espaço provavelmente o mais próximo possível
da realidade.
→ Fontes e Referências Bibliográficas:

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