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SEBENTA

BERNARDO MANUEL DE SOUSA PINTO


FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Sebenta de Biologia Celular e Molecular I

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ndice
Metodologia do estudo da clula...3
Microscopia.....3
Isolamento e cultura celular ....7
DNA e DNA-binding proteins.....11
Replicao do DNA.....15
Reparao e recombinao do DNA....19
Transcrio do DNA....24
Transcrio: Sntese do mRNA.....24
Transcrio: Sntese do rRNA e tRNA..........29
Ncleo celular..32
Genoma humano e doenas associadas ao DNA.37
Tcnicas de biologia molecular.......41
Sntese e degradao de protenas....45
Controlo da expresso gnica e especializao celular....51
Membranas biolgicas.....55
Transporte transmembranar .....58
Traduo elctrica de estmulos: Membrana neuronal....63
Modelos experimentais de controlo da expresso gnica....67
Citosqueleto.....72
Actina.....72
Microtbulos e filamentos intermedirios.........78
Atlas de Microscopia.......82
Tipos de clulas.....82
Ncleo............91




Esto includos nesta sebenta, resumos das aulas de Biologia Celular e Molecular I da Faculdade de
Medicina da Universidade do Porto, bem como um atlas com as imagens de microscopia observadas.
Desde j agradeo a quem me ajudou na elaborao da sebenta, atravs da correco de eventuais erros
inicialmente presentes, ou atravs de ideias e sugestes.
Bom trabalho e votos de sucesso nos exames,
Bernardo M. Sousa Pinto
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Sebenta de Biologia Celular e Molecular I

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Microscopia
O microscpio permite, no s, ampliar aquilo que vemos, mas tambm, ver mais pontos como pontos
distintos, pois permite uma resoluo maior que uma simples lupa. Existem dois grandes tipos de
microscpio: O microscpio de luz, onde possvel ver at s clulas, e o microscpio electrnico, que
teoricamente daria para ver at aos tomos.
Limite de resoluo
O limite de resoluo de um microscpio a distncia mnima entre dois pontos de um objecto, em que
estes so passveis de ser observados como pontos distintos, exprimindo-se em subunidades do metro.
O limite de resoluo do microscpio ptico calculado pela frmula


, sendo , o valor do
comprimento de onda da luz utilizada e o produto expresso no denominador muitas vezes indicado pelo
fornecedor.
O limite de resoluo mnimo do microscpio ptico, por causa da radiao de 200 nm, ou seja, no se
conseguem observar estruturas que distam menos de 200 nm, que a distncia mais ou menos que
existe entre os organelos. O microscpio electrnico tem um limite de resoluo terico de 0,1 nm, mas
na prtica, o limite de resoluo raramente menor que 1 nm.
Preparaes para microscopia
Para elaborar preparaes definitivas para microscpio ptico, em primeiro lugar, devemos parar os
processos metablicos das clulas, matando-as e conservando a sua estrutura fixao. De seguida,
corta-se o tecido endurecido (frequentemente em parafina) em fatias finas (entre 5 e 6 m de
espessura), pois s assim podem ser atravessadas por um feixe de luz. Finalmente, coloca-se este no
suporte de vidro.
Como as clulas so incolores, nomeadamente as animais, absorvem/reflectem muito poucas radiaes
visveis, devendo-se por isso fazer coloraes, utilizando-se corantes citolgicos, bsicos (ou acidfilos),
para corar estruturas cidas, como o ncleo (devido grande quantidade de cidos nucleicos), ou
corantes citolgicos cidos (ou basfilos), para corar estruturas bsicas (geralmente tm maior afinidade
com o citoplasma). Como as coloraes podem induzir alteraes morfolgicas nas clulas, h por vezes
a necessidade de observar clulas vivas e no coradas. Para isto, utilizam-se frequentemente,
microscpios de contraste de fase.
J em microscopia electrnica, os cortes tm de ser ultra-finos (80 a 100 nm), sendo estes colocados
numa grelha metlica e fixados numa cera muito dura.
Colorao de Gram
As clulas procariticas no tm ncleo, nem organelos membranares individualizados. As bactrias so
indivduos procariontes, que se classificam de acordo com o modo como coram, quando submetidas
tcnica de Gram. Sendo assim, as bactrias Gram-positivas coram a roxo e as bactrias Gram-negativas
coram a encarnado/magenta.
Estas diferenas em termos de colorao prendem-se com a presena ou ausncia de peptidoglicano
nas paredes bacterianas. As Gram-positivas possuem uma grande quantidade de peptidoglicano que
funciona como uma esponja muito grossa e permevel, enquanto as Gram-negativas possuem uma
quantidade muito reduzida de peptidoglicano.
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Microscopia de contraste de fase
A microscopia de contraste de
fase permite acompanhar
culturas de clulas vivas, pois
neste mtodo no necessria
a colorao histolgica das
clulas. As imagens so nos
dadas, pois, por um contraste,
que faz parecer que estas
apresentam relevo. Isto
acontece porque as radiaes
que atravessam organelos mais
densos e espessos, como o
ncleo sofrem um
retardamento, enquanto as que
atravessam regies de menor
resistncia, ficam em fase.
Dessa forma, essas diferenas
de fase de radiao, nos diferentes locais da clula, vo ser convertidas pelos microscpios de contraste
de fase, num contraste, onde estruturas mais densas so menos brilhante e as menos densas so
mais. Este mtodo til para observar clulas individuais, ou finas camadas de clulas, mas no tecidos
espessos.
O contraste de interferncia diferencial (ou contraste de interferncia diferencial de Nomarski) uma
variante da microscopia de contraste de fase, pois converte diferenas de fase tambm num contraste,
mas os objectos, nas imagens, parecem ter uma sombra, algo que resulta de uma diferena no ndice de
refraco deste, relativamente ao meio. Isto particularmente til para a observao de objectos
espessos e pequenos detalhes.
Microscopia de fluorescncia
Atravs de microscopia de fluorescncia, possvel detectar os fluorocromos, molculas fluorescentes.
Um composto diz-se fluorescente, caso absorva luz a um dado comprimento de onda de excitao e, por
consequncia, emita luz, num maior comprimento de onda especfico. So por isso detectadas duas
radiaes uma associada excitao dos electres e outra emisso de energia por parte destes.
Por isso, neste tipo de microscopia utiliza-se um filtro que deixa passar apenas as radiaes que excitam
os fluorocromos. Graas a outro filtro, vemos tambm somente as radiaes luminosas emitidas pelos
fluorocromos. O resto aparece a negro.
Dado existirem muito poucas molculas naturalmente fluorescentes, somos forados a recorrer a
tcnicas de imunocitoqumica utilizamos, pois, anticorpos com fluorocromos, pois os anticorpos so
muito especficos para determinados antignios. Podemos classificar as tcnicas de imunocitoqumica
em directas, se recorrerem somente a um anticorpo marcado para cada molcula, o que acontece
muito raramente; ou indirectas, se recorrerem a um anticorpo primrio, ao qual se ligam vrios
anticorpos secundrios marcados (sendo que os dois anticorpos tm de ser produzidos em animais
diferentes s assim os anticorpos secundrios reconhecem o anticorpo primrio como um antignio!).
Podem igualmente ser usadas enzimas com marcao fluorescente.
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Dado o contraste nas imagens de fluorescncia ser to grande, possvel ver estruturas menores que
200 nm, a menos que distem menos que 200 nm!
As imagens de microscopia de fluorescncia podem apresentar um fundo (noise), algo que superado
com recurso a radiao laser muito intensa, em microscpios mais sofisticados. A microscopia confocal
e de deconvoluo permitem observaes de estruturas tri-dimensionais sem aberraes de imagem. A
microscopia de Apo-Tome permite um aumento de nitidez nas imagens obtidas por microscopia de
fluorescncia.
GFP Green Fluorescent Protein
Esta protena permite-nos ver, com recurso a tcnicas de fluorescncia, clulas vivas, ou protenas (por
vezes criam-se protenas hbridas, com um segmento de GFP, que no altera o funcionamento natural
destas e permite observar o seu caminho natural).
FRET Frster resonance energy transfer
Esta uma tcnica de microscopia de fluorescncia, que permite observar a interaco directa entre
duas molculas muito prximas (nomeadamente reaces de transferncia de energia), do seguinte
modo:

FRAP Fluorescence recovery after photobleaching
Esta tcnica til para observao de cintica molecular, pois faz-se um branqueamento de todas as
molculas fluorescentes numa rea restrita e depois vai-se acompanhando as migraes moleculares, ou
seja, a sua recuperao.
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TIRF - Total internal reflection fluorescence microscope
Permite excitar os electres que esto mais superfcie na lmina, permitindo ver s molculas
individuais especficas.
Microscopia electrnica de transmisso
Este tipo de microscopia
electrnica utiliza um feixe de
electres, emitidos por um
filamento de tungstnio, aps ter
sido criada uma grande diferena
de potencial, o que mata clulas
eventualmente vivas. Como as
clulas so muito permeveis
passagem de electres e os
metais pesados no, cria-se uma
fixao base de elementos
densos, como o smio, ou o
acetato de uranilolevando
gnese de um contraste.
Em microscopia electrnica
aplicam-se tambm tcnicas de
imunocitoqumica,
nomeadamente
imunocitoqumica ultra-estrutural, onde, recorrendo a anticorpos marcados com metais pesados (p.e.
esferas de ouro), conseguimos detectar determinadas estruturas.
Microscopia crioelectrnica
Consiste na congelao muito rpida de material biolgico em azoto lquido, algo essencialmente til
para a identificao de vrus. Pode preceder o processo de sombreamento metlico, algo que
extremamente til para revelar o interior de biomembranas.
Sombreamento metlico
Consiste na colocao de um metal pesado no material biolgico, obtendo-se uma rplica da superfcie
que se consegue ver a microscpio electrnico espcie de um molde.
Microscopia electrnica de varrimento
Quando observamos estruturas em microscopia electrnica de varrimento, fazemos incidir electres em
ngulos diferentes, relativamente aos do microscpio electrnico de transmisso. Obtemos assim uma
imagem da superfcie do material biolgico (que no atravessado pelos electres), embora o limite de
resoluo neste tipo de microscpio seja menor.
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Isolamento e cultura celular
Isolamento de clulas
Microdisseco por laser
Este processo permite recortar regies da clula, muito selectivamente, submetendo-as a radiao
laser, aps estas terem sido cobertas por um polmero.
Citometria de fluxo
A citometria de fluxo permite a separao de clulas, atravs de diferena de cargas. Algumas clulas
so marcadas por fluorescncia, sendo que as marcadas, recebem uma determinada carga e as que no
tm recebem outra. feita posteriormente uma triagem com base nas cargas das clulas.
Cultura de clulas in vivo:
A cultura de clulas in vivo muito importante em termos cientficos, sendo aceite em termos ticos e
poupando recursos financeiros. Estas clulas so cultivadas em meio de cultura lquido, assptico,
suplementado com aminocidos, vitaminas e soro animal, estando todos os factores controlados. Para
alm disso, estas clulas mantm as caractersticas das originais. Contudo, existe a possibilidade da
contaminao destas culturas com microrganismos.
As clulas que retiramos podem se dividir num nmero limitado de vezes (normalmente podem
efectuar at 40 divises), morrendo posteriormente. Contudo, algumas clulas normais de roedores e
clulas tumorais tm capacidade de se dividir indefinidamente linhas de clulas imortais um
exemplo de clulas imortais, so as clulas da linha HeLa, a primeira linha celular, que foi isolada a
partir de um cancro do colo do tero.
Clulas imortais cultivadas in vivo so utilizadas na criao de clulas hbridas. As clulas hbridas
resultam da cultura de duas clulas com contedo gentico no muito diferente. Para se criarem clulas
hbridas, recorre-se ao polietilenoglicol, formando-se depois um heterocaryon, porque as membranas
das clulas tornam-se muito permeveis. Formam-se depois, por mitose, clulas com informao
gentica de ambos os tipos de clulas. As clulas hbridas so utilizadas, por exemplo, para a produo
de anticorpos monoclonais, por parte de hibridomas, clulas resultantes da fuso de linfcitos B com
clulas tumorais, o que lhes confere imortalidade. As clulas hbridas tm ainda aplicaes na
investigao e no diagnstico de patologias.
Isolamento de organelos:
Os organelos so isolados, de forma a permitir um melhor conhecimento da sua constituio, algo
essencial, por exemplo, para a produo de frmacos. Para proceder obteno de organelos isolados,
em primeiro lugar, a membrana citoplasmtica das clulas rompida, atravs de um mtodo mecnico
o homogeneizador. De seguida, procede-se a uma centrifugao, onde se aplica uma grande fora
centrfuga, maior que a da gravidade, de modo a obter um sedimento, constitudo pelas estruturas mais
densas e um sobrenadante, constitudo pelas restantes. O ncleo ser o primeiro organelo a constituir o
sedimento, dada a sua elevada densidade. Contudo, necessria a separao dos sobrenadantes, algo
que se faz recorrendo-se a uma centrifugao diferencial, a foras cada vez maiores.
Como as fraces obtidas nunca so 100% puras, utilizamos um gradiente, onde a base tem maior
concentrao de soluto (p.e. de sacarose) que o topo. Obtm-se a uma coluna com bandas, o que
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permite a purificao de sedimentos, quer constitudos por diferentes organelos, quer constitudos
somente por ncleos. Um controlo adicional da pureza feito, recorrendo ao microscpio electrnico.

Este processo pode ser utilizado para a obteno de macromolculas especficas isoladas. Neste caso, a
ultracentrifugao realizada conta de foras muito superiores e tempo muito longa, estando sempre
associada a um gradiente muito concentrado em soluto. As macromolculas, deslocam-se ao longo do
gradiente at encontrarem uma zona, cuja densidade seja igual s suas, estabilizando a. Todavia, esta
no a tcnica de excelncia para a separao de molculas como o DNA e o RNA.
Separao de protenas:
SDS-PAGE
Para separar protenas, recorremos electroforese, um processo que permite separar molculas com
carga elctrica, quando se encontram em soluo, atravs da aplicao de corrente elctrica, estando a
migrao das molculas dependente da sua carga, forma e massa.
No DNA, a migrao est apenas dependente da massa (associada ao nmero de pares de bases), visto
as molculas de DNA terem carga negativa (devido presena do anio fosfato) e forma similar, mas nas
protenas tal no acontece. Neste grupo de molculas verifica-se variedade na carga e forma, o que leva
a que tenhamos de realizar alguns processos, de modo a eliminar essas variveis e a podermos
separar as protenas somente pela sua massa.
Para eliminarmos a varivel carga, aplicamos SDS (dodecilsulfato de sdio), que confere carga
negativa a todas as protenas (estas ficam todas com a mesma carga). Isto leva tambm, a que haja
repulses entre as protenas, algo que ajuda sua desnaturao e linearizao. Posteriormente, aplica-
se DTT ditiotreitol e -mercaptoetanol agentes que quebram as pontes dissulfureto, contribuindo
para a perda de tridimensionalidade das protenas.
Aplica-se uma carga elctrica s protenas, ento em gel de poliacriloenil, que migram do ctodo (-), at
ao nodo (+), sendo que quanto maiores, menor a sua mobilidade. Para visualizarmos as bandas
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obtidas, estas so coradas com nitrato de prata e azul de Coomassie e comparar os valores obtidos com
valores-padro.
Focagem Isoelectrnica
Esta uma forma de electroforese, na qual as protenas so separadas de acordo com o seu ponto
isoelectrnico o valor do pH do meio, para o qual a protena fica globalmente neutra. Sabe-se que ao
ser aplicada electroforese em protenas neutras, estas no migram, por isso numa tina onde existe um
gradiente de pH, fornecemos corrente a protenas carregadas, sendo que estas migram at ao local
onde atingido o seu ponto isoelectrnico.

Electroforese bidimensional
As protenas so separadas com base nos seus pontos isoelectrnicos, por focagem isoelectrnica e
depois, por SDS-PAGE, pela sua massa molecular.
Western-blotting
O mtodo de Western-blotting consiste na transferncia das protenas separadas por electroforese
bidimensional para uma membrana. Aplica-se colorao de Ponceaus e depois aplicam-se os anticorpos
marcados com enzimas ou fluorescncia para identificar as protenas de interesse (imunoblotting).
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Separao e hibridao de cidos nucleicos:
No DNA, a migrao por electroforese feita em gel de acrilamida e agarose e est apenas dependente
da massa (associada ao nmero de pares de bases), visto as molculas de DNA terem carga negativa
(devido presena do anio fosfato) e forma similar. Dadas as dimenses da molcula de DNA, por
vezes necessrio cindi-la, com recurso a enzimas de restrio. A visualizao das bandas de DNA
possvel graas ao SYBR green (antigamente recorria-se ao brometo de etdio, contudo, este
cancergena).
possvel a hibridao de cidos nucleicos, podendo-se obter cadeias de DNA/DNA, RNA/RNA e
DNA/RNA. Para isso, aumenta-se inicialmente a temperatura das molculas originais, o que leva
quebra das pontes de hidrognio e desnaturao destas. De seguida, obtm-se molculas hbridas,
graas diminuio de temperatura.
Southern-blotting
O mtodo de Southern-blotting anlogo ao de Western-blotting. Esta tcnica capaz de detectar um
fragmento de restrio especfico, com uma enzima de restrio. Quando uma mistura de DNA
complexa submetida a electroforese notvel a presena de vrios fragmentos diferentes com
aproximadamente a mesma massa, no sendo detectvel, cada um, como uma banda particular. Dessa
forma, o southern-blotting recorre hibirdao para identificar um fragmento de DNA particular os
fragmentos de restrio so transferidos para uma membrana, que deixada a incubar em condies de
hibridao com uma sonda especfica de DNA marcada radioactiva. Aps se dar a hibridao dos dois
fragmentos, identificamos a sua localizao, por autoradiografia.
Nothern-blotting
O mtodo de Northern-blotting permite determinar a localizao da expresso de um gene particular,
sendo anloga para RNA que separado por electroforese e induzido em hibirdao com uma sonda de
DNA marcada radioactivamente. Este mtodo necessita da extraco de mRNA de uma clula ou
conjunto de clulas, dessa forma, para manter a informao posicional da clula, em estudos mais
precisos, necessrio realizar hibridizao in situ.










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DNA e DNA binding proteins
Molcula de DNA
A molcula de DNA apresenta como unidades bsicas os nucleotdeos, compostos por uma base
azotada, uma desoxirribose e um grupo fosfato. Ao conjunto da base azotada, mais a dexosirribose d-
se o nome de nucleosdeo. Quanto s bases, existem as pirimdicas, que so a timina e a citosina e que
apenas apresentam um anel azotado, e as pricas, que apresentam dois anis azotados, sendo por isso
a adenina e a guanina.
O grupo fosfato estabelece duas ligaes ster com a desoxirribose, dizemos por isso que se
estabelecem ligaes fosfodister na molcula de DNA. Uma das ligaes estabelecida no 5 carbono
da desoxirribose, enquanto a outra no 3 carbono de uma desoxirribose diferente. Dessa forma, a
sequncia de nucleotdeos sempre lida de 5 para 3.
A cadeia de DNA formada por dois polmeros lineares com tendncia a formar uma dupla hlice,
estabelecendo-se pontes de hidrognio entre as bases azotadas, de ambas as cadeias, que se dispe
antiparalelamente. Relativamente ao emparelhamento de bases, podemos afirmar que estas formam
sempre pares de Watson e Crick, ou seja a adenina emparelha sempre com a timina, atravs de duas
pontes de hidrognio e a guanina com a citosina, por 3 pontes de hidrognio. De referir que na molcula
de DNA distinguimos dois sulcos, um maior e outro menor, sendo que em cada volta, encontramos um
sulco de cada. J as pontes de hidrognio estabelecem um efeito velcro, pois so muito frgeis
individualmente, mas, no seu conjunto, constituem uma juno muito forte.
Relativamente aos tipos de DNA, quanto ao seu arranjo em dupla hlice, podemos considerar o BDNA, o
ZDNA e o ADNA. O BDNA corresponde
maior parte do DNA existente nas clulas.
Regista-se nele uma rotao para a direita
e existem 10,1 bases por volta completa
(que tem 3,6 nm). J o ADNA apenas
existe em laboratrio e em condies de
desidratao extrema, sendo por isso,
semelhante estrutura do BDNA, mas
mais compacto. Por ltimo, o ZDNA
apresenta uma rotao para a esquerda e,
embora por vezes se encontre nas clulas,
no se sabe qual a sua funo.
Desnaturao da molcula de DNA
A molcula de DNA muito estvel, todavia, a separao das duas cadeias possvel, atravs do
aumento de temperatura (dado a elevao trmica aumentar a cintica dos electres). A esta separao
d-se o nome de desnaturao do DNA, sendo este processo reversvel. Valores extremos do pH
tambm levam quebra das pontes de hidrognio, isto porque as cadeias passam a repelir-se, quer pelo
facto das bases ficarem protonadas (em meio cido), ou com carga negativa (em meio bsico). Tambm
a diminuio da concentrao de ies um factor que contribui para a desnaturao da molcula de
DNA.
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As quebras de ligaes nas molculas de DNA so
passveis de ser monitorizadas, atravs da
espectrofotometria. De facto, as cadeias simples
absorvem uma quantidade muito maior de
radiao UV de comprimento de onda 260 nm. A
temperatura para a qual se d um aumento
muito brusco da absoro de radiao de 260 nm
designada por melting-point (tambm
designado por temperature of melting, ou T
m
).
O melting-point mais elevado quando h mais
pares de bases guanina-citosina, do que quando
h mais pares de bases adenina-timina. Isto,
porque entre a guanina e a citosina estabelecem-se mais pontes de hidrognio, que entre a adenina e a
timina.
Disposio do DNA na clula
O DNA no se dispe aleatoriamente no ncleo das clulas
em interfase ocupa os chamados territrios
cromossmicos, locais restritos ocupados de forma
ordenada pelo DNA, entre os quais existe o espao
intercromossomal. O DNA encontra-se ento no ncleo
associado a protenas, o que constitui a cromatina. A
cromatina pode se encontrar sob uma forma muito
condensada (heterocromatina), ou pouco condensada
(eucromatina), estando essa ltima forma, geralmente
associada transcrio activa.
Quando se encontra em soluo hipotnica, o DNA
apresenta-se na forma de fibras de cromatina de 10 nm de
dimetro, assemelhando-se a um colar de contas, sendo que cada conta um nucleossoma a unidade
bsica de compactao de DNA nas clulas, constitudo por 147 pares de bases ligados a um octmero
(constitudo por um conjunto de oito histonas, de quatro tipos diferentes).
As histonas apresentam resduos de aminocidos carregadas positivamente, sendo que aps a traduo
destas possvel, que estas sofram alteraes (cdigo das histonas), que determinaro a sua funo e
compactao. Uma histona importante a H1, por permitir a formao de fibras de cromatina de 30 nm
de dimetro, estas fibras iniciam a sua formao pela orientao de duas colunas de DNA para esquerda
e enroladas sobre si prprias, originando depois, no seu conjunto, uma dupla hlice com orientao
para a esquerda.
De entre as histonas igualmente de destacar a aco da HP1, ao permitir uma maior condensao do
DNA, levando gnese de mais heterocromatina. Essa maior condensao est pois associada a
trimetilaes, enquanto as acetilaes esto sobretudo associadas a um impedimento da condensao
da cromatina.
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De referir, que este processo avana ciclicamente,
at aparecer um elemento de fronteira, que
impede o resto da proliferao da heterocromatina.
O processo da produo de heterocromatina pode
ser ento descrito pelo esquema da direita.
De entre a heterocromatina, igualmente
importante referir que existe heterocromatina que
est permanentemente condensada e que se
denomina heterocromatina construtiva, no sendo
praticamente transcrita.
Estrutura do cromossoma
O cromossoma apresenta DNA associado a protena,
designando-se cada molcula de DNA presente no
cromossoma por cromatdea. As cromatdeas esto
unidas por um centrmero. A extremidade do
cromossoma o telmero.
Existem protenas que, no sendo histonas,
desempenham importantes funes na manuteno
da estrutura do cromossoma loops de DNA
associados a um scaffold cromossmico de protenas
no histnicas, formam umas argolas designadas por SMC - Structural maintenance of chromosome.
A condensina entendida como largos complexos proteicos com uma funo fundamental na estrutura
de um cromossoma.
O caritipo entendido como o diagrama organizado dos cromossomas metafsicos de uma espcie e
tem em conta, o nmero de cromossomas de uma determinada espcie, a sua forma e tamanho.
DNA binding proteins
AS DNA binding proteins so as protenas que se ligam ao DNA (mais particularmente sua periferia),
estas tm acesso s bases no interior da molcula de DNA, sem ser necessrio desnatur-la. Isso
possvel, especialmente, graas ao sulco grande da molcula de DNA, que permite a exposio das
bases nucleotdicas. As ligaes estabelecidas entre o DNA e as protenas so muito especficas,
formando espcie de um efeito velcro.
Frequentemente, ligam-se ao DNA protenas com estrutura secundria em -hlice, mas as folhas
pragueadas tambm conseguem reconhecer a dupla hlice de DNA, bem como ansas de aminocidos
(como as da protena p53, supressora tumoral).
A helix-turn-helix um domnio comum de ligao ao DNA, sendo compostas por duas hlices e um
grupo turn, em ngulo fixo, sendo que uma hlice, a hlice de reconhecimento liga se major groove do
DNA. O basic helix-loop-helix (bHLH) uma variante, onde duas hlices esto conectadas por um loop.
Um caso particular de helix-turn-helix o homeodomain e observado nos repressores bacterianos.
O zinc finger o motivo mais abundante de ligao nos animais. Tem um tomo de zinco a unir vrios
resduos de aminocidos (entre 23 e 28), apresenta vrias formas possvel, mas geralmente, tem uma
hlice de reconhecimento.
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O leucin-zipper consiste em duas -hllices de DNA, unidas por interaces hidrofbicas, ao nvel das
leucinas. Est associada expresso de genes.
Os heterodmeros so resultado da juno entre o leucin-zipper e as hlice-ansa-hlice bsicas, tendo
diferente especificidade de ligao ao DNA. Contudo, o nmero de combinaes em cada clula
limitado, dependendo sempre da sequncia de aminocidos de cada cadeia.


















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Replicao de DNA
A replicao de DNA o processo pelo qual se formam 2 molculas de DNA exactamente, iguais quais
lhe deu origem e entre si. um processo semi-conservatvo feito por complementaridade de bases, algo
que foi comprovado numa experincia que utilizou istopos de azoto num gradiente de Csio.

DNA Polimerase
A DNA Polimerase a principal enzima a catalisar o processo de replicao DNA. Existem vrios tipos de
DNA polimerase nos procariotas, podemos referir as DNA Polimerases I, II e III (a DNA Polimerase III
a principal, adicionando nucleotdeos e tendo capacidade de proof-reading, as restantes, sobretudo a II
intervm somente no processo de reparao do DNA), enquanto nos eucariotas, so de salientar a DNA
polimerase (tambm designada por DNA primase), a DNA polimerase (que actua nos processos de
reparao de DNA) e as DNA polimerases / (com capacidade de adio de nucleotdeos e de proof-
reading. A DNA polimerase actua ao nvel da cadeia leading, enquanto a actua ao nvel da cadeia
lagging). A DNA Polimerase / a enzima mais importante nas clulas eucariticas, criando ligaes
difosfoster, de 5 para 3, quando as bases j esto emparelhadas, entre a molcula de DNA e um
desoxirribonucleosdeo trifosfato (levando libertao de dois fosfatos). Esta enzima similar a uma
mo fechada, com dedos, polegar e palma.
Esta enzima incapaz de adicionar os desoxirribonucleotdeos a uma cadeia simples. Tem que existir,
por isso, na cadeia de DNA, um pouco de ligao dupla. Isto algo que no acontece com a enzima DNA
primase.
Cadeia condutora (leading) e cadeia rpida (lagging)
Em microscopia electrnica possvel observar a replicao de DNA. As molculas de DNA circular vo
sendo abertas, havendo crescimento bidireccional das cadeias, com formao das forquilhas de
replicao. A forquilha de replicao a estrutura com forma de diapaso que se forma, aquando da
replicao do DNA. Nela distinguimos duas cadeias, a cadeia condutora, ou leading, e a cadeia lenta ou
lagging. A cadeia condutora aquela onde o DNA sintetizado de modo contnuo. A sua orientao 5
para 3 de acordo com a direco de sntese de DNA pela DNA polimerase. Por outro lado, na cadeia
lenta o DNA sintetizado de modo descontnuo, alternando os fragmentos de Okazaki com primers de
RNA.
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Os fragmentos de Okazaki so as sequncias de DNA, que se vo formando nas cadeias lentas e tm
cerca de 100-200 nucleotdeos nos eucariotas e 1000 a 2000 nos procariotas. Os primers de RNA so
pequenas regies de ribonucleotdeos, com 3 a 10 nucleotdeos, acrescentados pela DNA primase (DNA
polimerase ), de forma a ser possvel a sntese de DNA na cadeia lenta. Na cadeia leading tambm
necessrio um primer, para que se possa iniciar a replicao, dado que a DNA polimerase no pode
acrescentar nucleotdeos de novo.
A remoo dos primers feita por aco da RNase H. Dado a presena de ribonucleotdeos nas cadeias
de DNA ser facilmente detectada nas clulas como algo anmalo e aberrante, estes so fcil e
rapidamente removidos. Os espaos livres so ento preenchidos por desoxirribonucleotdeos
colocados pela DNA polimerase. A enzima DNA ligase, por seu turno, conta de ATP, estabelece a
ltima ligao fosfodister.
Protenas acessrias da DNA polimerase
A DNA helicase essencial ao processo de replicao do DNA, pois permite a abertura da dupla hlice e,
por outro lado, o desenrolamento das cadeias simples, aquando da formao de uma nova cadeia dupla.
Esta protena tem forma de anel, que progride, abrindo a cadeia de DNA.
Contudo, necessrio, que as cadeias simples, uma vez desenroladas, se mantenham simples. Esta a
funo da RPA Replication Protein A, que simultaneamente mantm as cadeias simples acessveis
deposio de novos nucletidos.
J a PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen uma protena com trs subunidades que permite que a
DNA polimerase esteja mais tempo ligada molcula de DNA e no se separe desta. Isto porque a DNA
polimerase, por si s, tem pouca afinidade com a molcula de DNA. Nos procariotas, a sua homloga a
sliding-clamp protein.
O RFC Replication Factor C - um complexo que trabalha em conjunto com a DNA polimerase e que
se est constantemente a formar e a dissociar na cadeia lenta, visto dissociar-se do complexo que forma
com a DNA polimerase e com a PCNA e da prpria molcula de DNA, quando se inicia a sntese de um
primer.
Nos procariontes, destaque ainda para a clamp-loading protein, que faz a hidrlise de ATP, permitindo
assim que ocorra a adio de desoxirribonucleotdeos.
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So igualmente necessrios
mecanismos que evitem a
ocorrncia de sobre-enrolamento
no DNA, funo assegurada pelas
topoisomerases, que do
pequenos cortes na molcula de
DNA, com esse intuito, e depois
restabelecem essas mesmas
ligaes fosfodister, por elas
quebradas. Existem duas classes
de topoisomerases a
topoisomerase I quebra a cadeia
simples de DNA e est muito
prxima da forquilha de abertura
e a topoisomerase II quebra a
cadeia dupla, assumindo um
papel fundamental para que
ocorra a separao dos
cromossomas e a mudana de
lugar da cadeia de DNA.
Ao conjunto formado entre a DNA
helicase a DNA primase d-se o
nome de primossoma.
Verificao da replicao pela DNA polimerase
Apenas um em cada 10
9
nucleotdeos incorporado incorrectamente durante a replicao de DNA.
Embora, ao ser realizada a polimerizao de nucleotdeos, um em cada 10
5
nucleotdeos seja
incorporado erroneamente, o mecanismo de exonucleotytic proofreading, operado pela enzima DNA
polimerase, permite que apenas subsista um erro em cada 10
2
nucleotdeos e o processo de Strand
directed mismatched repair, leva a que tambm apenas subsista um erro em cada 10
2
nucleotdeos. A
aco combinada destes trs mecanismos leva ento a que apenas passe um erro em cada 10
9

nucleotdeos sintetizados.
O processo de proof-reading da DNA polimerase possvel graas actividade de exonuclease desta
enzima. Este processo possvel de 3 para 5, sendo que a DNA polimerase reconhece os nucleotdeos
mal-emparelhados, pois esses no formam uma cadeia dupla correcta. A enzima em questo remove o
nucleotdeo errado e adiciona o correcto. Se a polimerizao de nucleotdeos ocorresse, eventualmente,
de 3 para 5 nalguma das cadeias, ao se operar o processo de proof-reading, quando fosse detectado
um nucleotdeo errado e, posteriormente, removido, a cadeia ficaria incompleta e no poderia crescer
mais.
Origem e velocidade da replicao
Em E. coli, as origens de replicao so regies do DNA ricas em pares A-T, que tm ligaes mais fracas
(por apenas duas pontes de hidrognio).
Nas clulas eucariticas, a velocidade de replicao 10 vezes mais lenta que nas procariticas, devido
presena de nucleossomas. Por isso, o genoma das clulas eucariticas tm obrigatoriamente vrias
origens de replicao, muito diferentes entre si s quais se ligam ORC Origin Recognition Complex
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protenas com 6 subunidades cuja funo a de reconhecer as regies de origem de replicao, ciclinas
e DNA-helicases. A um conjunto formado por entre 20 a 80 origens de replicao, d-se o nome de
unidade de replicao.
importante referir que o DNA no replica todo simultaneamente nas clulas eucariticas, replicando
primeiro a cromatina menos condensada (eucromatina), contudo, todo o genoma replicado.
Formao dos nucleossomas
Os tetrmeros de histonas H3 e H4 nunca se separam durante a replicao, contrariamente s H2A e
H2B. A sntese dessas histonas ento feita imediatamente aps a replicao de DNA. Como as
molculas recm-formadas de DNA possuem ento j histonas, as que se formam de novo, podem ser
depois modificadas de acordo com as que j esto ligadas ao DNA.
Replicao dos telmeros
A enzima telomerase assegura a replicao do DNA no telmero extremidade cromossmica, que
apresenta no ser humano a sequncia repetitiva GGGATT, pois este no sintetizado na cadeia lenta,
pois, como uma extremidade, seria a impossvel para a DNA polimerase sintetizar nucleotdeos.
Contudo, a maioria das clulas somticas no exprimem a enzima telomerase, contrariamente s clulas
tumorais e embrionrias. Dessa forma, vo ficando com as extremidades cromossmicas cada vez mais
curtas, at ao ponto dos cromossomas se fundirem. Essa perda cromossmica leva morte celular,
estando assim explicado, o motivo pelo qual as clulas somticas normais apenas tm capacidade de
efectuar 40 replicaes.



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DNA: Reparao e Recombinao
Danos no DNA
Cada clula humana sofre em mdia, por dia 10
4
a 10
6
eventos, fsicos ou qumicos, conducentes a
danos do DNA e, dessa forma, essencial para a clula possuir mecanismos de reparao do DNA. A
clula no pode evitar que se dem estes danos, visto que muitos so originados por produtos das
reaces metablicas celulares, sendo a sua ocorrncia normal.
De entre os danos que se registam no DNA, salientamos as reaces de hidrlise, de entre as quais,
despurinaes reaces de hidrlise, em que as bases pricas deixam de o ser e as desaminaes
remoo de um grupo amina nas bases citosina, adenina e guanina. Tambm os danos oxidativos, onde
h perda de ligaes oxidativas contribuem para leses no DNA, bem como as alquilaes, de onde se
salientam as metilaes, onde grupos metilo se ligam a tomos de azoto.
Contudo, no so apenas agentes endgenos que contribuem para as leses do DNA. A exposio a
certos agentes exgenos, como as radiaes UV, que levam formao de dmeros de timina ou
citosina, ou alguns produtos qumicos, que levam por exemplo a metilaes e etilaes, propicia
ocorrncia de danos na molcula de DNA.
Cada cadeia de DNA apresenta uma cpia (um backup), devido ao facto de se encontrar ligada a uma
cadeia com bases complementares. Isto faz com que a molcula de DNA seja a molcula ideal para
armazenamento de informao gentica. A presena de apenas quatro nucleotdeos diferentes facilita
igualmente, a reparao de erros.
Reparao directa do DNA
Existem mecanismos de reparao directa do DNA,
nomeadamente a reverso directa (direct reverse) de um dmero
de timina, formado aquando da exposio a radiao UV e que
possvel em bactrias e algumas clulas eucariticas, sendo
levada a cabo por uma enzima. Algumas enzimas das clulas
humanas tm tambm a capacidade de cortar um grupo metilo
indevidamente ligado a um nucleotdeo.
Reparao por remoo e substituio de bases ou
de nucleotdeos
O processo de base-excision-repair (reparao por exciso de
uma base) til para quando ocorrem desaminaes, um tipo de
mutao muito frequente. Dessa forma, quando devido a este
tipo de mutaes, se geram nucleotdeos errados, a enzima DNA-
glicosilase quebra as ligaes entre a base nucleotdica e a
desoxirribose, deixando o local apurinco, ou apirimdico temos
ento um AP-site. Os AP-sites tambm se podem formar por
perda espontnea de uma base.
De seguida, a AP endonuclease corta a ligao fosfodister entre
dois nucleotdeos, no AP-site e a desoxirribosefosfodiesterase,
uma exonuclease, remove o que restava daquele nucleotdeo
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antigo. Isto permite finalmente que a DNA
polimerase e a DNA ligase possam repor o
nucleotdeo correcto.
Todavia, muitas mutaes no podem ser
corrigidas simplesmente pela remoo de uma
base e um nucleotdeo mutado altera, inclusive, a
configurao local da molcula de DNA. Quando
temos dmeros de timina e de citosina, o processo
utilizado a nucleotide excision repair, onde as
helicases removem uma grande quantidade de
nucleotdeos adjacentes ao dmero.
Posteriormente, reconstri-se a regio em falta,
com recurso DNA polimerase e DNA ligase.
Nas clulas dos mamferos, estes danos do DNA
so reconhecidos pelas protenas XPA XPG
(sendo que algumas destas protenas tm
tambm funo de helicase e at endonuclease),
e mutaes nestas levam doena Xeroderma
pigmentosum, onde se registam frequentes
tumores cutneos.
O processo de reparao do DNA associada transcrio em clulas eucariticas (transcription-coupled
repair) importante na medida em que as mutaes do DNA so reparadas mais rapidamente se
ocorrerem numa regio transcricionalmente activa, pois as RNA polimerase que esto a fazer a
transcrio param se encontrarem um dano que lhes impea de realizar a sua funo. Essa paragem
prontamente detectada pelas protenas CSA e CSB que activam as protenas XPA-XPG, que realizam um
processo que ser depois similar ao anterior. Associado deficincia na capacidade das clulas
repararem DNA que est sendo transcrito, temos o sndrome de Cockayne, cujos pacientes apresentam
desordens multi-sistmicas.
Reparao associada replicao
Aps ocorrer replicao de DNA, a enzima DNA
polimerase tem capacidade de proof-reading e detecta
emparelhamentos errados, substituindo-os por correctos.
Porm, por vezes escapam mismatches. Estes
mismatches so detectados e corrigidos pelo processo de
mismatch repair, que ocorre aps a replicao do DNA.
A deteco de regies onde ocorrem mal-
emparelhamentos feita conta de protenas,
nomeadamente, nos procariotas, as protenas Mut (Mut
S, Mut L e Mut H), que reconhecem nucletidos
metilados. A Mut L, a Mut S, uma helicase e uma
exonuclease contribuem para a exciso do fragmento
onde se encontra o nucletido mal-emparelhado.
Finalmente, a DNA polimerase e a DNA ligase colocam um
fragmento correcto, em substituio.
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Nos eucariotas, o mismatch repair operado pelas protenas MSH. O reconhecimento do mismatch
levado a cabo pela MSH2 e MSH6, a exciso pela DNA helicase, pela DNA exonuclease, pela MLH1
endonuclease e pela PMS2. Finalmente, a regenerao da cadeia fragmentada levada a cabo pela DNA
polmerase e pela DNA ligase. Apesar disso, no se sabe muito bem como que as MSH detectam quais
os nucletidos que foram colocados erradamente. Mutaes nas protenas MSH leva a uma tendncia
para os indivduos desenvolverem cancro do colo do tero e colo-rectal.
Reparao error-prone
Quando nenhum dos
mecanismos enumerados
anteriormente funciona e
quando, aquando de uma
nova replicao, a DNA
polimerase encontra uma
situao aberrante (por
exemplo, um dmero de
timina), esta enzima pra a
sua actividade, pois no
sabe o que fazer. Passa
ento a actuar uma nova
DNA polimerase a DNA
polimerase error-prone
que no tem capacidade
de proof-reading e inicia a
polimerizao de nucleotdeos toa, inserindo muitos por estimativa (e obviamente, muitos errados).
Contudo, isto evita que a clula morra, algo que aconteceria, caso no ocorresse replicao, de todo. A
cadeia nova que se forma, serve ento como
molde para a remoo do erro que estava na
cadeia original. Este processo designa-se por
reparao por translesion DNA synthesis, ou
reparao error-prone.
Reparao por end-joining
O processo de reparao por end-joining ocorre,
quando se verificam quebras na dupla cadeia de
DNA. Ocorre ento o reconhecimento dessas
extremidades por parte das protenas Ku e por
aco destas e de outras protenas, ocorre
remoo de nucleotdeos prximos das
extremidades e, depois, juno destas. Isto, claro,
leva a perda de informao gentica.
Recombinao homloga do DNA

J o processo de recombinao homloga do DNA
ocorre entre regies homlogas de cromossomas
muito similares, aquando de um fragmento num
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dos cromossomas. Ocorre ento remoo da
regio em torno das extremidades do
fragmento, por aco de uma exonuclease e
forma-se posteriormente um heteroduplex,
aps uma strand invasion, operada pelo
cromossoma homlogo. O heteroduplex
formado permite que a cadeia com a regio
fragmentada, por complementaridade de
bases, relativamente ao cromossoma
homlogo, possa preencher a regio em
falta.
As protenas RecA (nos procariontes) e Rad51
(nos mamferos) so essenciais para a
formao do heteroduplex, pois catalisam a
ligao de uma cadeia simples de DNA a uma
dupla. A protena Rad52 favorece a ligao da
Rad51 cadeia simples de DNA. As regies de
heteroduplex podem migrar da cadeia dupla,
espalhando-se por branch migration. Isto
pode ocorrer sem aco de enzimas (e ento
ocorre bidireccionalmente) ou,
unidireccionalmente, com aco de enzimas
(com funo de helicase). Neste processo no
ocorre perda de nucleotdeos.
A recombinao molecular gentica homloga
que ocorre na meiose muito similar reparao por recombinao. A Spo11 e a Mre11 vo comear
por provocar falhas na molcula de DNA de um cromossoma, estimulando-a invaso do cromossoma
vizinho, promovendo-se assim a recombinao gentica homloga, atravs das junes de Holliday
(uma juno mvel entre quatro cadeias de DNA).

Isto permite o processo
designado por crossing-
over, que ocorre em cerca
de 10% das molculas de
DNA, bem como o processo
de converso gentica.
Enquanto no processo de
crossing-over ocorre uma
troca de segmentos entre
cromossomas, no processo
de converso gentica um
cromossoma transfere uma
pequena poro para outro (sem que haja perda de informao gentica para o cromossoma dador). A
recombinao pode ser prevenida, caso no haja homologia entre as sequncias de nucleotdeos,
atravs de um mecanismo de mismatch repair.

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Recombinao no-homloga do DNA
A recombinao no-homloga de DNA no implica homologia de sequncias especficas de DNA.
Participam neste processo, recombinases que funcionam de modo similar s topo-isomerases. As
recombinases reconhecem dadas sequncias de DNA, cortam-nas e recombinam-nas com sequncias
no-homlogas. Este processo de site specific recombination muito importante para a formao dos
anticorpos e da, 25000 genes originarem cerca de 10
11
anticorpos diferentes. Este processo de RV(D)J
Recombination possvel graas presena das protenas RAG 1 e RAG 2, expressas especificamente
nos linfcitos.




Esta diversidade tal de anticorpos essencial ao funcionamento do sistema imunitrio dos vertebrados,
na medida em que permite que uma imensa quantidade de antignios seja reconhecida.
Amplificao gentica
Em algumas clulas como as tumorais ou de ovcito, alguns genes so replicados muitas vezes (muito
amplificados) antes de se dar a replicao completa do genoma total, num processo designado por
amplificao gentica. Isto permite aumentar a influncia que esse gene apresenta no fentipo.















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Transcrio: Sntese do RNA mensageiro
A ribose o monossacardeo presente na molcula de RNA. Esta estrutura tem um grupo HO, em vez
de um grupo H, no carbono 2, como acontece com a desoxirribose. Isto torna o RNA muito mais
reactivo e leva a que este se encontre, quase sempre, sob a forma de cadeia simples (estrutura primria
do RNA). Apesar disso, o RNA pode assumir estruturas tri-dimensionais, que determinam diferentes
funes. De entre as estruturas secundrias formadas encontramos o hairpin e o stem loop e de entre
as tercirias, destaque para o pseudo-n. A formao de estruturas tri-dimensionais do RNA muito
importante, na medida em que permite a activao de reaces qumicas, por parte do RNA. As
ribozimas so ento RNA com actividade enzimtica.
RNA polimerases e RNAs transcritos
A transcrio de DNA entendida pela polimerizao de RNA utilizando uma cadeia molde de DNA,
adicionando-se ribonucleotdeos por complementaridade de bases. O crescimento da cadeia de RNA
ocorre sempre de 5 para 3, sendo a reaco catalisada pelas RNA polimerases, sem necessidade da
adio prvia de primers. Existem trs classes de RNA polimerases que codificam diferentes RNAs:
Estas enzimas distinguem-se tambm pela diferente sensibilidade a uma toxina, a -amanitina, sendo
que a RNA polimerase II mais sensvel que a RNA polimerase III a RNA polimerase I lhe insensvel.
Todas as RNA polimerases so constitudas por vrias subunidades, algumas delas homlogas com as da
DNA polimerase, sendo a estrutura dessas subunidades muito conservada durante a evoluo. De entre
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as subunidades encontramos duas maiores do tipo (as quais nos eucariotas, denominamos por RPB1 e
RPB2), duas do tipo e uma do tipo . As RNA polimerases adicionam erradamente 1 em cada 10000
nucleotdeos. Contudo, estas enzimas possuem capacidade de proof-reading (no to elevada como a
da DNA polimerase).
A RNA polimerase II apresenta, numa das suas subunidades grandes, uma cadeia carboxlica terminal (C
Terminal Domain), que constituda por cadeias repetidas de sete aminocidos, variando o nmero de
repeties entre 26 e 52 (so 52 nos vertebrados). Esta cadeia sofre hiperfosforilao durante a etapa
de iniciao da transcrio, sendo essencial no processo de transcrio, nomeadamente, em regies
onde existe muita actividade nesse sentido.
Transcrio do DNA em mRNA
O processo de transcrio de DNA inicia-se ao nvel do nucleotdeo +1. Todos os nucletidos que se
encontram antes desse nucletido, dizem que se encontram a montante, ou upstream, sendo
contados negativamente. Dos nucletidos que se encontram depois, diz-se que esto a jusante, ou
downstream, contando-se positivamente. Este processo envolve genericamente trs etapas iniciao
(que concerne a abertura da cadeia de DNA, ficando desemparelhados 14 nucleotdeos), a fase de
alongamento e a terminao.
As sequncias de consenso so sequncias com cerca de 10 nucleotdeos, que so muito conservadas e
que se encontram prximas dos locais de incio de transcrio. A estas sequncias, da qual exemplo a
TATA box, ligam-se factores proteicos, essenciais para que a RNA polimerase possa actuar. Alguns genes,
contudo, no necessitam de sequncias de consenso dos promotores para serem transcritos,
apresentando estes, normalmente, baixa actividade transcriptiva. Existem ainda regies do DNA que
funcionam como activadoras e de aumento da actividade transcriptiva so os Promotor-proximal
elements, que se encontram 100 a 200 bp upstream do local +1 e os enhancers, a mais de 200 bp do
local +1 (quer upstream, quer downstream). O complexo mediador o responsvel por fazer a ponte
entre a RNA polimerase II e as regies activadoras.

A TBP liga-se TATA box, seguindo-se o TFIID (o maior transcription factor destes aqui presentes) e o
TFIIB (TF significa transcription factor). Liga-se ento a RNA polimerase II e, simultaneamente, o TFIIF.
Por ltimo, liga-se o TFIIE e o TFIIH, ficando assim formado o complexo de iniciao. O TFIIH tem funo
de helicase, permitindo a abertura da cadeia de DNA e de sntese, ligando grupos fosforilados cadeia
carboxlica terminal (a ordem de ligao dos factores de transcrio dada pela mnemnica, Deus
Bom, F Em altura, representando-se a altura por h como na fsica).
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Assim que se d a fosforilao da CTD e adio do primeiro
ribonucleotdeo, desmonta-se o complexo de iniciao e
inicia-se a fase de alongamento. Nas clulas eucariticas, a
velocidade de adio de ribonucleotdeos muito
reduzida, nomeadamente devido ao super-enrolamento
verificado no DNA, a jusante da RNA polimerase e que
gerado pela prpria enzima (que paradoxalmente facilita o
desenrolamento do DNA volta das histonas nos
nucleossomas). Contudo, o recurso a topo-isomerases
para desenrolar a cadeia por vezes necessrio.
No pr-mRNA formado existem sequncias de
ribonucleotdeos que assinalam o incio e o fim da
transcrio. O incio marcado pelo elemento upstream,
enquanto o fim marcado pelo elemento downstream.
Processamento
Aps a transcrio forma-se um pr-mRNA, ou seja um
mRNA que ainda no sofreu processamento e que ainda
no est pronto para ser traduzido. O processamento
conduz assim formao de um mRNA maduro e envolve a
ocorrncia de capping, clivagem, splicing e poli-adenilao.
O capping ocorre na extremidade 5, que se liga a uma
guanosina, quando o mRNA comea a sair da RNA polimerase (atravs de uma ligao 5-5). Essa
guanosina ento metilada, originando-se 7-metilguanosina. O cap permite a proteco da
extremidade 5 da degradao enzimtica e que aquela molcula seja reconhecida como mRNA. Por
outro lado, o cap um factor que contribui no transporte do mRNA para o citoplasma. De referir que o
capping ocorre concomitantemente metilao da ribose do primeiro nucleotdeo.
Ao mRNA recm-formado ligam-se tambm protenas (levando formao de ribonucleoprotenas -
RNP), com o objectivo de prevenir a formao de estruturas tri-dimensionais e de reconhecimento de
sequncias de nucleotdeos. Existem igualmente RNA-binding proteins, cujo objectivo o de manter a
estabilidade do RNA.
Na clivagem (cleavage)
ocorre um corte na
molcula de pr-mRNA,
no sentido da regio do
elemento downstream
(ou seja na extremidade
3), algo que catalisado
por endonucleases e que
requer a existncia de
factores de estimulao
deste processo,
nomeadamente o CstF e o
CPSF.
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O processo de splicing, por sua vez, consiste na remoo dos intres do pr-mRNA. Quando este
muito longo e contm muitos intres, o splicing feito ainda aquando da transcrio. Contudo, quando
o pr-mRNA pequeno, ocorre mais ou menos simultaneamente splicing e poli-adenilao. A poli-
adenilao um processo que consiste na adio de uma cauda poli-A (sem que seja necessria a
adio de outras estruturas prvias), constituda por uma elevada quantidade de adeninas,
extremidade 3, por aco da enzima PAP (polyadenylate polymerase). A cauda poli-A impede a
degradao do mRNA, podendo-se ligar protenas a esta estrutura as poli-A binding proteins.
Para que ocorra splicing necessria a interveno de pequenos RNA, que reconhecem regies de
intres e promovem a sua eliminao da cadeia de mRNA. O mecanismo de splicing envolve ento o
reconhecimento de trs sequncias de consenso do intro o local de splicing em 5, o local de splicing
em 3 e o branch point (stio de ramificao, onde a extremidade 5 se vai ligar) Dessa forma,
compreende-se que o emparelhamento entre o pr-mRNA e os pequenos RNA (nomeadamente os
pequenos RNA U1 e U2) seja essencial para que ocorra este processo. O primeiro pequeno RNA a ligar-
se o U1, na extremidade 5 de um intro. Seguem-se as protenas/factores de splicing BBP e U2AF e
posteriormente liga-se, no branch point, o pequeno RNA U2. Ligam-se depois os pequenos RNAs U4, U5
e U6, sendo formado um complexo ribo-proteico, ao qual se d o nome de spliceossoma, que tem
aproximadamente a massa de um ribossoma. Aps sucessivas ligaes RNA-RNA, que envolvem gastos
de ATP, o intro eliminado da cadeia de RNA, sob a forma de lariat intron (intro em forma de lao) e,
j sob a forma linear, degradado no interior do ncleo, por aco de enzimas.
De forma a no serem removidos os exes, durante o processo de splicing, ligam-se protenas aos exes
as protenas SR. Os intres, de maiores dimenses, formam complexos hnRNP (heterogeneous
nuclear riboproteins) e so posteriormente degradados. Estas ligaes so fundamentais, de forma a
permitir que o spliceossoma distinga intres de exes. Se um exo for removido indevidamente, podem
ser originadas patologias, da qual exemplo a atrofia muscular espinhal.

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Nas clulas eucariticas h outros mecanismos de splicing, que so, contudo mais raros, nomeadamente
o splicing do tipo U12, que ocorre com ligao do pequeno RNA U11 extremidade 5 do intro e do
pequeno RNA U12 ao branch point. J o trans-splicing consiste num mecanismo, em que dois exes
separados se ligam, ocorrendo concomitantemente remoo do fragmento de intro que entre eles se
interpunha. Este processo ocorre com a interveno de pequenos RNA e caracterstico do
Trypanosoma e dos nemtodos.
Em alguns protozorios existe self-splicing, onde o prprio RNA catalisa as reaces de splicing, sem que
haja interveno de protenas. No self-splicing, um cofactor de guanosina liga-se ao local de splicing em
5 do intro, que tem actividade enzimtica (Grupo I); ou o prprio intro apresenta uma adenosina que
ataca o local de splicing em 5, catalisando a sua clivagem (Grupo II) e, consequentemente, a sua
prpria remoo. O splicing alternativo ocorre em fragmentos que contenham muitos exes, podendo
ser removidos alguns, sem perda de funo celular e, como tal, podem ocorrer inmeras combinaes
entre exes, o que contribui para um aumento da variabilidade gentica. Analogamente ao splicing
alternativo, existe tambm cleavage alternativa.





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Transcrio do DNA: Sntese do tRNA e do rRNA
Numa clula em crescimento rpido, cerca de 80% do RNA rRNA, sendo que quanto maior for a
actividade metablica da clula, maior a percentagem de rRNA. O tRNA, por sua vez, conta cerca de 15%
da quantidade de RNA existente na clula e apenas 5% do RNA celular mRNA.
Sntese do rRNA
A RNA polimerase I participa ao nvel da sntese de rRNA, actuando unicamente ao nvel dos nuclolos,
onde este processo ocorre. Um nuclolo constitudo por um componente fibrilar denso, um centro
fibirlar e um componente granular. O componente fibrilar
denso, que apresenta um aspecto mais escuro, quando
visualizado em microscopia electrnica, o local onde
ocorre sntese activa de rRNA. Este migra para o
componente granular, o local do nuclolo, onde visvel a
presena de grnulos de cerca de 15 nm de dimetero e
onde ocorre a maturao do rRNA, atravs da sua
clivagem. O centro fibrilar apresenta um aspecto mais
claro, onde est presente o DNA codificante de rRNA, que
no est transcricionalmente activo naquele momento.
Finalmente, completada a maturao, o rRNA migra para o
citoplasma.
No final da telofase, aparecem vrios pequenos nuclolos, que depois se unem, aquando da replicao
do DNA e se separam outra vez, aquando da mitose. Como j foi referido, quanto maior forem as
dimenses e o nmero de nuclolos, maior a actividade metablica da clula.
Os genes que codificam os nuclolos, no final
da telofase, so os NOR (organizadores
nucleolares), que no se encontram no
nuclolo (nesta estrutura apenas
encontramos genes que codificam para
rRNA), mas nos pares de cromossomas
13,14,15, 21 e 22.
A transcrio activa de rRNA pode ser
observada atravs das imagens de rvore de
Natal. A bactria E. coli apresenta 7 cpias
para o gene que codifica rRNA, enquanto o
ser humano tem entre 200 e 250 cpias, no
sendo todas transcritas activamente, em
simultneo. Este nmero muito elevado de
cpias, permite a produo de muitas cpias
de rRNA por intervalo de tempo. Estas cpias
dispe-se numa sequncia em tandem
array, constituda por sequncias de
unidades de transcrio intervaladas com
DNA spacers, que no so transcritos. Nas
unidades de transcrio, existem ainda
partes que so transcritas, mas no so
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codificantes.
No DNA que codifica o pr-rRNA, existe um upstream
element (UCE), a entre 155 e 60 nucleotdeos a montante do
local de incio da transcrio e um core element que se
encontra no local entre -40 e +5. Para a RNA polimerase I se
ligar aos promotores necessrio que se liguem primeiro
factores de transcrio, nomeadamente, o UBF (upstream
transcription factor), o Selectivity Factor 1 (SL-1, composto
pelos TAF) e o core factor (CF). O UBF tem como funo o
reconhecimento do upstream element (sendo por isso um
upstream binding factor), ao qual se liga tambm o SL-1. O
core factor reconhece o core element. Uma das subunidades
do SL-1 a TATA binding protein, apesar de no DNA em
questo no existir nenhum promotor com sequncia
homloga TATA box.
Aps ocorrer o processo de transcrio (que fica completo
aquando da clivagem da extremidade 3 do DNA), forma-se
um transcripto primrio com 45S (unidades de
sedimentao), que vai sofrer um processamento, que inclui
clivagem ( retirada a extremidade 5 e as regies no
funcionais) e modificaes qumicas nas bases (por exemplo, metilaes nas riboses). Este transcrito
originar, ento, por clivagem, uma cadeia de 28S, uma de 5.8S (unindo-se estas duas, que se formam a
partir de uma de 32 S, para originar o que ser a subunidade grande do ribossoma, juntamente com
uma cadeia de 5S) e uma cadeia de 20S (que depois passar a 18S, originando a subunidade pequena do
ribossoma).
O pequeno RNA U3 o responsvel pela remoo da extremidade 5, sendo que as restantes regies
no-codificantes de RNA so clivadas e imediatamente degradadas por enzimas. Os snoRNAs (pequenos
RNAs nucleolares), que so pequenos RNAs que so transcritos
pela RNA polimerase II, pela RNA polimerase III e at por
intres, participam no processo de processamento de RNA,
nomeadamente, por complementaridade de bases, permitem
a exposio das bases que devem ser metiladas ou sofrer
outras alteraes. Os snoRPs box C+D posicionam uma enzima
que metilar bases do pr-rRNA (tendo, por isso, actividade de
metil-transferase), enquanto os snoRNPs box H + ACA
posicionam uma enzima que converte a uridina em pseudo-
uridina.
O RNA ribossomal 5S integra a subunidade grande do
ribossoma e sintetizado pela RNA polimerase III. O complexo
de iniciao envolve a presena dos factores de transcrio
TFIIIA, TFIIIB e TFIIIC (TF significa transcription factor), sendo o
promotor associado a este processo a box c.
O ribossoma no apenas constitudo por rRNA,
apresentando tambm protenas. O processamento do rRNA
ocorre simultaneamente associao com protenas, sendo
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que a subunidade pequena produzida
mais depressa que a grande, pois
comea-se a ligar a protenas ainda na
fase de transcrio. J a subunidade
grande sofre a clivagem final no
citoplasma, aps ter migrado, algo
importante, na medida em que, isto
impede que a sntese de protenas ocorra
no ncleo. De referir que a subunidade
grande sofre tambm controlo de
qualidade (depois de actuarem helicases,
com o objectivo de fazer a clivagem de
eventuais snoRNAs que se ligaram ao
rRNA). O transporte desta subunidade
tambm muito lento, visto que esta do
tamanho do poro nuclear, tendo que se
desligar primeiro a maior parte das
estruturas que lhe estavam ligadas.
A RNA polimerase III tem como funo a sntese do tRNA, que ocorre ao nvel do nucleoplasma. Para se
formar o complexo de iniciao para a RNA polimerase III, ligam-se primeiro o TFIIIC (que se liga aos
promotores box A e box B) e o TFIIIB. Aps a transcrio, o tRNA sintetizado sofre clivagens
(nomeadamente na extremidade 5 e na extremidade 3). Depois, adicionada extremidade 3, uma
sequncia CCA, essencial para a ligao dos aminocidos, aquando do processo de traduo. Segue-se a
modificao de cerca de 10% dos nucletidos do tRNA, podendo este ainda sofrer splicing. O splicing no
tRNA ocorre exclusivamente por aco de enzimas proteicas, nomeadamente endonucleases,
fosfotransferases e ligases. Os tRNA produzidos so exportados para o citoplasma, atravs do complexo
de poro nuclear por aco de uma exportina.
Aquando da sntese de snRNAs na presena da RNA-polimerase III, o promotor apresenta a TATA box,
estando ligados ao promotor o TFIIIB e o SNAP, aquando da presena do complexo de iniciao.











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Ncleo celular
O ncleo um organelo extremamente dinmico e que apresenta grandes dimenses,
comparativamente aos restantes organelos celulares (cerca de 6 m, nas clulas dos mamferos). A
presena deste organelo um elemento-chave para fazer a distino entre clulas eucariticas e
procariticas.
Observao e estudo do ncleo celular
O ncleo cora por aco de corantes bsicos, devido presena substancial de cidos nucleicos.
Contudo, estes corantes no permitem distinguir o DNA e o RNA. Dessa forma, o mtodo de Feulgen
emprega-se com o fim de evidenciar histologicamente somente o ncleo ocorre remoo do RNA
existente nos ncleos, por aco do cido clordrico, dando-se a quebra entre as ligaes ocorridas entre
as bases pricas e os grupos desoxirribose. Isto permite que haja reaco com o reagente de Schiff e que
o DNA aparea visvel, de cor vermelha. Utilizando esta tcnica, os nuclolos aparecem incolores, pois
so, sobretudo, compostos por RNA. A
observao do ncleo por imunofluorescncia
igualmente possvel, sendo utilizado o DAPI, um
corante fluorescente, que se liga ao DNA, sendo
emitida, por consequncia, uma cor azul.
O mtodo da contrastao regressiva do EDTA
permite igualmente o estudo do ncleo celular
entre a aplicao de acetato de uranilo e citrato
de chumbo, utiliza-se EDTA, um cido que
permite a obteno de um negativo do que
seriam as imagens de normal contraste, isto , as
partes claras correspondem a locais de maior
presena de DNA e as partes mais escuras a
locais como fibirlas e grnulos. Os ncleos
celulares podem igualmente ser isolados e
purificados por ultracentrifugao, sendo os
primeiros organelos a sedimentar, devido sua
massa.
Territrios cromossmicos e corpos nucleares
As molculas de DNA, em interfase, no ocupa reas aleatrias do
ncleo, designando-se essas reas restritas ocupadas por cada
cromossoma por territrio cromossmico. Aps cada ciclo celular, os
cromossomas continuam a ocupar aproximadamente os mesmos
territrios cromossmicos. Entre esses territrios, existem domnios
intercromossmicos, onde ocorrem reaces muito importantes.
No ncleo encontramos vrios domnios, denominados corpos
nucleares (tambm designados por domnios nucleares), que no
so rodeados por membranas, mas que mesmo assim, apresentam
concentraes elevadas de protenas especficas e RNAs, o que leva
formao de estruturas quase esfricas. Os corpos nucleares mais
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proeminentes so os
nuclolos. Contudo, existem
muitos outros que tm vindo
a ser detectados devido a
tcnicas de
imunofluorescncia ou
contrastao progressiva por
EDTA.
Os focos ou fbricas de
replicao so os locais onde
se origina a replicao
cromossmica, sendo que
estes s se observam durante
a fase S do ciclo celular. J os domnios de transcrio podem ser observados recorrendo a tcnicas de
imunofluorescncia, quer no ncleo, quer nos nuclolos.
Os locais onde ocorre a sntese e amadurecimento dos rRNA so os nuclolos, locais onde possvel
distinguir um componente fibrilar denso, um centro fibrilar e um componente granular. Os nuclolos
so formados em torno de loci especficos os NORs (regies organizadoras de nuclolos).
As fibrilas pericromatnicas esto sempre entre os domnios intercromossmicos, na periferia da
cromatina condensada. As fibrilas so enriquecidas em RNA e provavelmente so locais de splicing do
pr-mRNA e de poliadenilao.
Os grnulos pericromticos so regies cuja funo ainda no bem conhecida. Provavelmente,
participam na acumulao de transcritos primrios de RNA pr-mensageiro, que no sofreram
amadurecimento (por exemplo, splicing), no tendo sido ainda degradados. Em microscopia electrnica,
estes grnulos so regies escuras, rodeadas por uma aurola clara.
Os gnglios intercromatnicos so tambm designados por speckles, sendo pequenas estruturas de
difcil visualizao, devido ao facto de no se encontrarem em regies de ocorrncia de splicing. Pensa-
se que estas estruturas esto relacionadas com o armazenamento de snRPs e protenas envolvidas no
splicing de pr-mRNa, que so lanadas no nucleoplasma, quando necessrio.
Os corpos espiralados, tambm designados por corpos de Cajal so locais onde os pequenos RNAs so
produzidos, sofrem maturao e so reciclados. Acredita-se que o processamento das histonas do
mRNA tambm ocorre ao nvel dos corpos de Cajal. Cada clula eucaritica tem entre 3 e 10 corpos de
Cajal e estes so identificados graas presena de coilina, o seu principal componente. Esta protena,
que permite a ligao do corpo de Cajal ao nuclolo, hibridiza com a GFP, permitindo a deteco dos
corpos de Cajal.
Os corpos nucleares PML (Promyelocytic Leukemia) apresentam essa designao (associada leucemia),
pois neles est presente uma mutao em indivduos que padecem de leucemia. Existem entre 10 e 30
corpos nucleares PML por ncleo, embora no haja certeza relativamente sua funo. Provavelmente,
estes corpos funcionam como locais para modificao de complexos proteicos envolvidos na reparao
de DNA e na induo de apoptose.
Os corpos nucleares simples e os corpos nucleares complexos tm ainda funo desconhecida, embora
se saiba que surgem aquando de um estmulo hormonal.
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A matriz nuclear entendida como um citosqueleto do ncleo. Desconhece-se se esta existe de facto,
ou se as observaes que induzem a crer na existncia desta estrutura no so mais que o resultado das
preparaes agressivas (quer por mtodo de Comerford, quer por mtodo de Kaufmann) s quais o
ncleo sujeito, quando se procura averiguar a existncia da matriz.

Invlucro nuclear
O invlucro nuclear delimita o ncleo e formado por
uma membrana externa (com ribossomas associados e
em continuidade com o retculo endoplasmtico rugoso),
uma membrana interna, separada da externa pela
cisterna perinuclear. Profundamente, membrana
interna encontramos a lmina nuclear, que fibrosa e de
difcil visualizao e dissociao. A atravessar o invlucro
nuclear encontramos poros nucleares.
Relativamente s lminas nucleares, sabe-se que estas
estruturas contribuem para a regulao da replicao do
DNA e da diviso celular, para a organizao da
cromatina e como forma de ancorar os complexos de
poro nuclear. As lminas nucleares, ao ligarem-se
firmemente membrana interna, do mais resistncia ao
ncleo. Estas estruturas so compostas por laminas (as laminas A, B e C), cuja fosforilao leva
desagregao do invlucro nuclear durante a profase. A desfosforilao das laminas leva
reorganizao do invlucro nuclear. Quando ocorrem mutaes nas lminas nucleares podem ocorrer
laminopatias, patologias que resultam muitas vezes em progerias (doenas do envelhecimento
acelerado) e distrofias musculares.
O complexo do poro nuclear formado por nucleoporinas e est fortemente ligado lmina nuclear.
Estes complexos so estruturas de grande dimenso que apresentam simetria octogonal, formando uma
estrutura em cesto. Estes complexos so essenciais para o processo de transporte nuclear.
Os canais aquosos so constitudos tambm por nucleoporinas, dispostas num arranjo em malha,
podendo ser atravessados por pequenas molculas ou ies, por difuso simples. Molculas com massa
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molecular superior a 40 kDa podem atravessar os canais aquosos, mas esse transporte depende de um
rearranjo da malha das nucleoporinas, de modo a ser possvel formar um espao maior.
Importao e exportao de protenas
A importao de protenas do citoplasma levada a cabo pelas importinas. Estas protenas ligam-se a
protenas ligadas a NLS (sequncias de reconhecimento nuclear) no citoplasma, formando o complexo
de carga. O complexo, por sua vez, entra no nucleoplasma, juntamente com o Ran-GDP. No citoplasma,
o Ran-GDP fosforilado ( conta de GTP, numa reaco que envolve o composto GEF - guanine
nucleotide exchange factor como agente intermedirio), originando Ran-GTP, que se liga
importina, levando ao desligamento da protena de carga. O complexo formado pelo Ran-GTP e pela
importina atravessa ento o poro nuclear e no citoplasma, este desmembra-se, por desfosforilao do
Ran-GTP.
J a exportao de protenas do ncleo feita conta da formao de um complexo, no ncleo, que
envolve a ligao de uma exportina a uma protena ligada a NES (Nuclear export sign) e a Ran-GTP. Este
complexo atravessa o poro nuclear e no citoplasma desmembra-se, devido desfosforilao do Ran-
GTP. Posteriormente, a exportina que libertada no decurso dessa reaco entra sozinha no ncleo.
As protenas responsveis pela importao e pela exportao de protenas (importinas e exportinas) so
genericamente classificadas como carioferinas.
A exportao de tRNAs e subunidades ribossomais ocorre de forma similar, mas o tRNA liga-se
directamente exportina-t, enquanto as subunidades do ribossoma ligam-se exportina Crm1.


Importao e exportao de RNA
A exportao de mRNA do ncleo no depende de Ran-GTP, sendo controlada por fosforilao e
desfosforilao de protenas. Os mRNAs so ento transportados pelo complexo de poro nuclear atravs
do mRNA exporter, um heterodmero. A ligao entre o mRNA e o complexo levada a cabo pelo Factor
de exportao nuclear 1 (NXF1) e ocorre conta de uma desfosforilao. Ainda no ncleo, antes do
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mRNA atravessar o poro nuclear, algumas protenas dissociam-se nos complexos formados, algo que
ocorre conta de uma fosforilao do complexo Npl3 associado ao mRNA. Outras so exportadas
juntamente com o mRNA, dissociando-se no citoplasma (passando, depois, livres para o ncleo).
Os snRNA, por sua vez, so exportados do ncleo integrados num complexo proteico. Estes complexos
atravessam o poro nuclear e dissociam-se no citoplasma. A entrada nos snRNAs para o ncleo feita por
via de complexos proteicos com vrias binding proteins os snRNPs.
As hnRNPs (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins) so complexos formados com pr-mRNA e
protenas, como forma de indicar que o mRNA ainda no foi processado e que, como tal, ainda no est
preparado para ser transportado. Dessa forma, a exportao de RNAs funciona como um sistema de
controlo dos RNAs transcriptos. Os mRNA so transportados apenas aps splicing completo e os tRNA
aps modificaes nas bases nucleotdicas.












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Genoma humano e doenas associadas ao DNA
O caritipo de um organismo definido pelo seu nmero, tamanho e forma dos cromossomas. O
caritipo humano constitudo por 23 pares de cromossomas, sendo cada cromossoma constitudo por
um brao longo (q) e um brao curto (p). A identificao dos genes feita em primeiro pelo nmero do
cromossoma onde se encontram, seguindo-se a letra correspondente ao brao e depois o locus.
Genoma e complexidade dos organismos
O genoma humano constitudo por cerca de 30 000 genes, tendo cada regio codificante 1,4 kb e um
gene 30 kb. Cada gene contm oito exes (com 135 bp) e 7 intres (2200 bp). A densidade genica de
apenas 11,5 genes por cada mega par de bases. Isto mostra que o nmero de regies no-codificantes
do nosso genoma muito maior que o nmero de regies codificantes.
Na verdade, a complexidade dos organismos est intimamente relacionada com a percentagem de
regies no-codificantes no genoma, nomeadamente sequncias repetidas, pois quanto maior for esta,
mais complexos so os organismos. De resto, a complexidade dos organismos no est relacionada com
o tamanho dos genomas nem com o nmero de genes/cromossomas que estes apresentam.

Constituio do genoma humano
Os genes so constitudos por exes (que constituem entre 3 a 5% do genoma humano) e intres, sendo
os intres regies no-codificantes. Do genoma humano fazem ainda parte os pseudogenes unidades
no-funcionais resultantes da duplicao de genes previamente existentes. Estas duplicaes do DNA
ocorrem aquando da replicao de um gene original e vo adquirindo mutaes ao longo do tempo,
sem que para isso comprometam o organismo. Isto um importante factor evolutivo, na medida em
que o pseudogene vai adquirindo caractersticas prprias e, eventualmente, funcionalidade, o que est
na base do aparecimento de famlias proteicas.
O conceito de um gene, uma protena est hoje completamente obsoleto, pois devido aos processos
de splicing alternativo, ou por locais alternativos de incio (alternative transcription start sites) e fim da
transcrio (alternative transcription termination sites), um determinado gene origina mais que um
mRNA e, por consequncia, mais que uma protena. De referir que a mesma poro de DNA pode conter
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genes diferentes, sobrepostos e em orientao oposta. Por exemplo os intres de um dado gene podem
conter os exes de outro gene garantido a no partilha de regies exnicas.
Tambm existe RNA no
codificante (ncRNA), que no
traduzido (no originando,
portanto, nenhuma protena), mas
que desempenha funes
importantes na clula.

Sequncias repetidas do genoma
No genoma humano existem sequncias repetidas, que se podem classificar em sequncias repetidas
em tandem e sequncias intercaladas.
As sequncias repetidas em tandem
so tambm denominadas por DNA
microsatlite e consistem em
repeties de um pequeno conjunto de
nucletidos. Estas sequncias
classificam-se como STR (short tandem
repeat), caso o nmero de repeties
seja inferior a 10, ou VNTR (variable
number of tandem repeat), caso o
nmero de repeties seja inferior a 50.
Estas repeties originam-se aquando
da replicao do DNA e, dado o seu grau elevado de variabilidade, so amplamente utilizadas em testes
de paternidade ou na investigao forense, em processos como o DNA fingerprint. As sequncias
repetidas em tandem representam cerca de 10% do nosso genoma.
As sequncias intercaladas so tambm
designadas por transposes e so
elementos mveis no-funcionais, que
constituem entre 30% a 45% do nosso
genoma. O processo pelo qual estes
elementos mveis so copiados e inseridos
em novos locais no genoma denominado
de transposio.
Os DNA transposes so obtidos por cpia
de uma sequncia de DNA e colagem
noutro stio, enquanto os retrotransposes
formam-se atravs de uma cpia de RNA,
que atravs da enzima transcriptase
reversa reconvertida em DNA, que se
insere noutro stio. Os retrotransposes
podem ser de vrios tipos, destacando-se
os SINEs (short interspersed repeated sequences), cujo nmero de bases inferior a 500, e os LINEs
(long interspersed repeated sequences), que tm origem viral.
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Os transposes so importantes veculos em termos de evoluo e diversidade gentica, uma vez que a
transposio gentica, ao ocorrer, arrasta consigo, por vezes, genes adjacentes, que ao mudarem de
posio adquirem novas funes. Contudo, o processo de transposio ocorre muito pouco
frequentemente na espcie humana, verificando-se sobretudo ao nvel das clulas germinativas.
Calcula-se que uma transposio ocorra nos seres humanos uma vez, em cada oito indivduos!
Mutaes
Uma mutao entendida como uma qualquer alterao na sequncia de DNA. Estima-se que ocorra
uma taxa de trs mutaes por indivduo em cada gerao, sendo as suas causas diversas. Parte das
mutaes so transmitidas hereditariamente, mas existem outras que esto associadas a danos no DNA
provocados por factores ambientais (como o tabaco), ou agentes qumicos (como a radiao UV).
Tambm eventos genticos como a recombinao ou a transposio podem levar ocorrncia de
mutaes. De referir que o ltimo nucletido do codo o menos importante e o que mais sofre
mutaes.
Os polimorfismos so modificaes do genoma humano, que so frequentes (a sua frequncia na
populao excede o 1%, algo que ocorre por exemplo ao nvel da anemia falciforme, que representava
uma vantagem evolutiva nos pases onde a malria endmica, visto proteger os indivduos contra essa
doena). Podem ser silenciosos ou manifestar-se, por exemplo, como uma patologia. Contudo, mesmo
os polimorfismos silenciosos podem se manifestar atravs de uma ligeira alterao ou subtilezas no
modo de funcionamento, por exemplo, de uma dada protena.

As mutaes podem ser classificadas como gnicas (pontuais), se ocorrerem somente numa base ou
estruturais (cromossmicas), caso seja afectada uma grande poro do cromossoma. Relativamente s
mutaes de bases, podemos citar a formao de dmeros de timina por aco da radiao UV, a
metilao de citosinas, que pode levar formao de timinas e o facto das sequncias repetidas em
tandem serem locais frequentes de insero/deleco, levando gnese de mutaes durante a
replicao.
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Em termos de mutaes cromossmicas, podemos referir as deleces (perda de segmentos
cromossmicos), as translocaes (modificao do cromossoma onde estava inserido determinado
segmento), as inverses (modificao do local de um dado segmento cromossmico, dentro do prprio
cromossoma) e as alteraes do nmero de cpias dos cromossomas. Estas mutaes estruturais esto
geralmente associadas a graves patologias.
Embora as mutaes sejam frequentemente entendidas como algo negativo, a verdade que estas so
o grande motor da evoluo. J aqui foi referido, a ttulo de exemplo, o caso do aparecimento dos
pseudogenes. Tambm a mutao que leva manifestao de anemia falciforme no fentipo no de
todo prejudicial uma alterao gnica presente nas populaes de origem africana, visto ser benfica
na proteco contra a malria.
O OMIM a base de dados que apresenta toda a informao conhecida sobre patologias genticas.



















Tcnicas de Biologia Molecular
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Cerca de 40% do genoma humano ainda est por caracterizar, nomeadamente genes que
aparentemente no tm relaes com patologias ou com funes bsicas do organismo. O estudo do
genoma assenta em vrias tcnicas, que se tm vindo a revelar teis em termos de avanos da
medicina. As tcnicas de biologia molecular passam pela anlise de cidos nucleicos, pela anlise de
protenas e pela regulao da expresso gnica.
PCR
O PCR (Polymerase Chain Reaction) uma tcnica que permite amplificar um fragmento de DNA
atravs da utilizao de dois primers especficos que determinam o incio e o fim da regio a amplificar.
igualmente necessria a Taq DNA polimerase - uma DNA polimerase que obtida atravs da bactria
Thermus aquaticus e que suporta elevadas temperaturas, pois este processo ocorre em condies
trmicas que para a maioria das enzimas so incapacitantes. Finalmente, so necessrios
desoxirribonucleotdeos, que vo sendo acrescentados s cpias de DNA produzidas.
O PCR consiste em 30
ciclos de 3 passos cada
a primeira etapa a
desnaturao da dupla
cadeia de DNA (ou seja
separao das cadeias),
algo que ocorre a uma
temperatura situada
entre 90 e 100C. O
segundo passo prende-
se com a ligao dos
primers esta ocorre a
temperaturas situadas
entre os 50 e 65C e
designa-se por
annealing. Finalmente,
o processo de
elongao ocorre a
72C, temperatura
ptima para a Taq DNA
polimerase, sendo
neste processo adicionados os restantes nucletidos. De referir que apenas ao fim de trs ciclos,
conseguimos ter cadeias duplas com os fragmentos a ser amplificados com as dimenses certas.
Actualmente, utiliza-se muito o PCR em tempo real (Quantitative Real Time PCR), pois este processo
permite acompanhar a reaco de amplificao ao longo do tempo, atravs da molcula de CYBR green,
que fluorescente e se intercala na cadeia dupla de DNA. A quantidade de fluorescncia apresentada
assim proporcional quantidade de DNA produzida.



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Sequenciao de DNA
O metdo de Sanger actualmente o mais utilizado para levar a acabo a sequenciao de DNA, apesar
de apenas ser possvel a sequenciao de uma cadeia de cada vez. Para que este processo ocorra
necessrio que um fragmento de DNA j tenha sido previamente amplificado.
Para que este mtodo ocorra, a sntese de DNA ocorre in vitro, sendo os fragmentos colocados em locais
onde existam primers (para ser levada a cabo a iniciao), nucletidos normais e nucletidos stop.
Existem ento quatro locais onde decorrer a sequncia, sendo que cada local apresenta um tipo de
nucleotdeo stop diferente (um deles apresenta guanina stop, o outro citosina stop), contudo, em
todos eles apenas existe 1 nucleotdeo stop em cada 100 nucleotdeos. Os nucleotdeos stop, que so
na verdade dideoxirribonucleosdeos trifosfato (ddNTP), apresentam um grupo H ligado ao terceiro
carbono, em vez de um grupo OH. Isto significa que, aps um ddNTP ter sido integrado numa cadeia de
DNA, mais nenhum nucleotdeo pode ser acrescentado a esta.

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Dessa forma, as reaces procedem de
forma muito simples As DNA polimerases
vo integrando nucletidos nos diferentes
fragmentos de DNA presentes. Quando
calha de integrar um nucletido stop numa
cadeia de DNA, a polimerizao nessa
cadeia pra, mas continua nas outras, at
integrao de nucletidos stop nestas.
Depois, para analisar a sequncia de DNA
procede-se electroforese em gel de
agarose, havendo revelao por
autorradiografia ou anlise automtica
por uma mquina sequenciadora.



DNA microarray
O DNA microarray, ou chip array, permite analisar em simultneo a expresso diferencial de milhares
de genes em populares celulares diferentes, algo particularmente til para o estudo de doenas
polignicas, como o Alzheimer, a esquizofrenia, ou o cancro.
Para levar a cabo este processo, extrai-se o mRNA de indivduos de dois grupos, sendo que atravs da
trasncriptase reversa procede-se sntese do respectivo cDNA. O cDNA depois marcado com cores
fluorescentes diferentes, para distinguir os grupos. Os cDNAs so depois misturados e hibridizados com
as cadeias presentes nos chips (onde encontramos todos os genes com uma localizao conhecida em
diferentes spots). De seguida, procede-se sobreposio dos scans obtidos nos chips, permitindo, pelas
cores registadas em cada spot compreender quais os genes expressos em ambos os grupos e em cada
um dos grupos.
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Isto permite, a ttulo de exemplo, classificar vrios
tipos de cancro, nomeadamente que se traduzem
num fentipo similar, de acordo com o seu perfil de
expresso gentica. Isto muito til para a
administrao de uma terapia personalizada, de
acordo com as caractersticas genticas do indivduo.
DNA recombinante em bactrias
O DNA recombinante permite a insero e
propagao de DNA (por exemplo, um gene que
codifica uma protena de interesse) em bactrias
(geralmente a E. coli) e requer para isso uma insero
contendo o gene de interesse, um vector (um
plasmdeo, geralmente). Os plasmdeos so pores
de DNA circular, que no so essenciais para a
sobrevivncia das bactrias e cuja replicao
independente da do restante DNA bacteriano,
apresentando por isso uma origem de replicao.
Neste processo intervm enzimas de restrio,
endonucleases que reconhecem sequncias
especficas de 4 a 8 nucletidos e que fazem a
clivagem dessas sequncias palindrmicas (ou seja, que apresentam um eixo de simetria). Essa clivagem
origina extremidades blunt (ou seja, extremidades em que o corte feito de forma abrupta,
orientado segundo uma linha recta), ou extremidades coesivas (extremidades em que o corte feito
em ziguezague, formando uma espcie de encaixe) nos fragmentos de DNA. De referir que apenas so
utilizadas neste processo as enzimas que fragmentam o DNA, deixando extremidades coesivas.
O fragmento de DNA ento introduzido e integrado no plasmdeo, por aco da enzima DNA ligase (a
maior parte das vezes utilizada a T4 DNA ligase). A entrada do plasmdeo para a bactria, por sua vez,
feita por choque trmico (transformao bacteriana por mtodo qumico), ou por um choque
elctrico (transformao bacteriana por electroporao).
Para seleccionarmos quais os indivduos que apresentam
a insero, colocamos as bactrias num meio com um
antibitico, visto que na insero sempre colocado
juntamente com o gene de interesse, um gene que
confere resistncia a um antibitico, j com o intuito de
fazer essa seleco. Obviamente, que as bactrias que
no apresentam a insero morrem, aquando do
contacto com o antibitico.
Finalmente, as bactrias sobreviventes so ento
colocadas num meio de cultura, de forma a possibilitar a
sntese da protena de interesse.
Actualmente, possvel realizar o processo de
transfeco insero de plasmdeos em clulas
eucariticas e, inclusive, usar outros vectores que no
plasmdeos, tais como fagos lambda.
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Sebenta de Biologia Celular e Molecular I

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Sntese e degradao proteica
Todos os componentes celulares tm um tempo de semi-vida, o qual designado por turn-over e isto
inclui as protenas, sendo que o seu turn-over varivel de acordo com a sua utilidade (protenas mais
importantes, tm um perodo de semi-vida maior) e da ser importante falar em sntese e degradao
proteica.
O dogma central da biologia celular assenta na ideia de que o DNA transcrito em RNA, sendo a
informao contida no mRNA traduzida em protenas. Contudo, importante referir que para a sntese
proteica no intervm apenas o mRNA o tRNA tambm essencial, porque trazem aminocidos para o
ribossoma, enquanto molculas de rRNA esto contidas na maquinaria dos ribossomas.
Estrutura do mRNA
O mRNA apresenta, na sua extremidade 5, um cap (7-metilguanoisna, que vital para o
reconhecimento e ligao do mRNA ao ribossoma, bem como para a proteco contra exonucleases) e
na sua extremidade 3, uma cauda poli-A, que contm entre 150 a 200 nucletidos de adenina e que
protege o mRNA da degradao. No mRNA est ainda contida uma regio, a ORF (ou Open Reading
Frame), que contm o conjunto de informao que ser traduzida, sendo a ORF ladeada pela 5UTR e
pela 3UTR, regies que no sero traduzidas, mas que contm informaes sobre o turn-over do mRNA.
As regies UTR (Untranslated Regions) contm, portanto, informaes relativamente estabilidade do
mRNA, contribuindo para esta. De referir que o mRNA sempre lido de 5 para 3 e a construo dos
polipeptdeos sempre feita do terminal amina, para o terminal carboxilo.

Dada a redundncia do cdigo gentico (um aminocido pode ser codificado por vrios codes), cada
aminocido pode se ligar a vrios tRNAs. Apesar disso, no existe ambiguidade no cdigo gentico, ou
seja, um codo no pode codificar vrios aminocidos. Existem ainda trs codes stop (UGA, UAA e
UAG, decorveis atravs da mnemnica U Go Away, U Are Away, U Are Gone), que no so
reconhecidos por nenhum aminocido, e um codo de iniciao (AUG, o nico codo que codifica a
metionina). Com excepo da metionina, o triptofano o nico aminocido codificado tambm por um
s codo (UGG). De referir que o cdigo gentico utilizado pela mitocndria varia ligeiramente.
Estrutura do tRNA
O tRNA tem uma estrutura em forma de trevo,
tendo quatro loops, um dos quais contm o
anticodo, sequncia pela qual o tRNA se liga
ao mRNA. Na extremidade 3 do tRNA
encontramos a sequncia de ligao ao
aminocido.
O nmero de molculas de tRNA diferentes
igual ao nmero de codes diferentes
existentes. Contudo, os tRNAs com anticodes
redundantes no existem na clula na mesma frequncia, havendo preferncia de codes em todos os
organismos.
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46

Quando temos uma molcula de
tRNA ligada a um aminocido,
dizemos que temos um aminoacil-
tRNA. As aminoacil tRNA sintetases
catalisam a formao de aminoacil
tRNA. Em primeiro lugar, um
aminocido especfico liga-se ao seu
respectivo local de ligao,
concomitantemente ao ATP, que se
liga ao seu local prprio nesta
sintetase. O ATP ento
desfosforilado, originando AMP,
ocorrendo a esterificao dos
aminocidos. Aquando da ligao do
tRNA ao seu local especfico naquela enzima, o AMP desliga-se da enzima e o tRNA pode finalmente
ligar-se ao aminocido em causa, formando-se assim um aminoacil-tRNA.
Ribossomas
O ribossomas so ribozimas, pois o RNA presente (rRNA) tem aco cataltica. Estas estruturas so
constitudas por duas subunidades a subunidade grande apresenta 49 protenas e um coeficiente de
sedimentao de 60 S, enquanto a subunidade pequena apresenta 33 protenas e um coeficiente de
sedimentao de 40 S. Contudo, o coeficiente de sedimentao total do ribossoma de 80 S e no de
100 S, porque a sedimentao num gradiente de densidade no depende apenas do tamanho da
estrutura, mas tambm da sua forma. De referir que a percentagem de RNA num ribossoma maior que
a de protenas, estimando-se que seja de 60%. Os rRNAs apresentam estruturas secundrias e tercirias,
sendo estas conservadas em todas as espcies.
Podemos considerar trs locais nos ribossomas o local A (ou aminoacil) o local por onde entram os
aminoacil-tRNAs. Por outro lado, o local P (ou peptidil) aquele em que se forma a cadeia peptdica. Por
ltimo, o local E o local exit, por onde sai o tRNA. De referir que o resduo C-terminal permanece
ancorado no local P ao seu tRNA.
Nos procariontes, os ribossomas apresentam 70S (a subunidade grande apresenta 50S e a pequena
30S), sendo a percentagem de RNA cerca de 66%.
Traduo
A traduo comporta trs etapas a iniciao (fase mais importante, pois aquela em que se registam o
mecanismos de controlo), o alongamento e a finalizao.
Iniciao
Em primeiro lugar, a subunidade pequena do ribossoma, liga-se ao mRNA, no local de iniciao, que se
inicia com a sequncia AUG. Depois liga-se o tRNA iniciador (com a metionina) a essa regio, sendo a
metionina depois removida na maior parte das protenas.
A traduo comea sempre no codo de iniciao AUG, sendo a sua identificao essencial para definir
que protena se quer de facto produzir, dado que existem vrios quadros de leitura (reading frames)
possveis no RNA. Este codo ento encontrado pelo seu contexto nos procariontes existe uma
sequncia 8 bp upsteram (a montante) ao AUG inicial (a sequncia de Shine-Dalgarno), que se vai
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emparelhar com uma sequncia complementar, encontrando-se esta na extremidade 3 de uma
unidade de 16S de rRNA. Nos eucariotas, temos em torno do codo AUG uma sequncia Kozak muito
conservada, que reconhecida por um scan feito pela subunidade pequena do ribossoma.
O tRNA de iniciao que se liga ao codo AUG sofre ento fosforilao nos eucariontes e formilao nos
procariontes. Este tRNA o nico que se liga ao lugar P do ribossoma e as alteraes referidas tm por
objectivo, permitir a ligao deste tRNA ao local P. De resto, todos os outros aminoacil tRNAs ligam-se
ao local A. Associados ao processo de iniciao, existem factores de iniciao (IFs para os procariontes e
eIFs para os eucariontes).
Nos procariontes, o IF1 liga-se ao local A para que nele no se ligue outro tRNA, o IF2 liga o aminoacil
tRNA de iniciao ao local P e o IF3 impede a ligao das duas subunidades e destabiliza a capacidade de
outros tRNA se ligarem ao local P. Forma-se ento um complexo de pr-iniciao, em conjunto com a
subunidade pequena. O IF2-GTP posteriormente hidrolizado, o que leva ligao da subunidade
grande e formao do ribossoma funcional.
J nos eucariontes, o eIF1A e o eIF2 tm funo similar aos IF1 e IF2, respectivamente. O eIF4 remove as
estruturas secundrias do mRNA e ao ligar-se s extremidades, permite formar um loop entre o cap e a
cauda poli-A. Caso o loop no possa ser formado, nomeadamente, devido ausncia de cap, ou a uma
pequena extenso da cauda, o mRNA degradado nos Processing bodies (P-bodies), que existem no
citoplasma e so estruturas dinmicas, aparecendo e desaparecendo. Depois deste controlo de
qualidade (etapa limitante da iniciao), o eIF3 e o eIF6 associam-se respectivamente s subunidades
pequena e grande, mantendo-as separadas. O aminoacil-tRNA liga-se ento subunidade pequena,
ajudado pelo eIF2-GTP, forma-se um complexo nesta subunidade. Aps esta fase, os eIF4 ligam-se
subunidade pequena e fazem um scan, de modo a encontrar a sequncia de Kozak e o codo de
iniciao. Posto isto, d-se a hidrlise do eIF5 e do eIF2, algo que leva dissociao dos factores de
iniciao e adio da subunidade grande. Forma-se ento um ribossoma funcional de 80S e a traduo
prossegue para a fase de alongamento.
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H, contudo, nos eucariontes quantidades muito pequena de mRNA que podem ser traduzidas de forma
similar dos procariontes, sem existir scanning (sendo a traduo, por isso, independente do cap),
referimo-nos aos locais de iniciao internos (IRES), que existem no mRNA, aquando de stress ou
infeces virais.
Alongamento
O processo de alongamento muito
similar nos eucariotas e nos
procariotas. Os aminoacil tRNAs vo
se ligar ao mRNA, atravs do local A
do ribossoma. Em termos de
factores de alongamento,
encontramos os EFs nos
procariontes e os eEFs nos
eucariontes.
Em primeiro lugar, o aminoacil tRNA
entra para o local A, ligando-se ao
mRNA, sendo a cadeia polipeptdica
entretanto formada transportada
para o aminoacil RNA, algo que
ocorre concomitantemente
hidrlise do GTP. O tRNA que ficou
livre no local P (uncharged tRNA) ento expulso pelo local E, ficando o lugar que ocupava (lugar P),
preenchido pelo polipeptil tRNA, que se encontrava no local A, atravs de um processo designado por
translocao e que ocorre custa da hidrlise de GTP.
Para serem formadas ligaes peptdicas entre os diferentes aminocidos intervm uma enzima a
peptidil transferase, presente na subunidade grande do ribossoma. De referir que a cadeia nascente sai
sempre pelos aminocidos iniciais (a metionina a primeira estrutura a sair, saindo primeiro o grupo
amina).
Terminao
Os codes stop, no tm tRNA correspondente. Os RFs (Release Factors) so parecidos com o tRNA
estrutural, o que permite que estes factores entrem no local A do ribossoma, levando separao do
complexo ribossmico (nos eucariotas temos o eRF1 para trs codes STOP, enquanto para os
procariotas temos o RF1 para actuar nos codes UAG e UAA e o RF2 para actuar nos codes UGA e
UAA). O RF3 (nos eucariotas, eRF3) uma protena associada ao GTP, que atravs da hidrlise deste,
promove a quebra do complexo peptidil-tRNA. Por ltimo, voltam-se a ligar, s subunidades
ribossomais, o eIF3 e o eIF6, de modo a manter as subunidades separadas.
Folding proteico
Associada traduo, temos sempre chaperones, protenas que facilitam o folding da protena em
formao, mediando a sua estrutura correcta, algo que ocorre conta de gastos energticos. As HSP
(heat shock proteins) so protenas com aco de folding proteico, cujos nveis esto aumentados em
situaes de choques trmicos, de forma a responder ao aumento da desnaturao das protenas.

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Optimizao do processo de traduo
Dado o facto de a traduo ser um processo que envolve gastos energticos, a verificao prvia do
mRNA muito importante. Por outro lado, os procariontes acoplam a transcrio com a traduo,
enquanto nos eucariontes, como a
traduo muito lenta, esta
realizada em polirribossomas (os
polirribossomas so tambm
designados por polissomas e so uma
srie de ribossomas que traduz uma
mesma cadeia de mRNA), ou
associada ao retculo endoplasmtico
rugoso. A traduo por polissomas
permite aumentar a velocidade e taxa
de sntese proteica. Esta tambm
aumentada pela reciclagem das
subunidades ribossomais.
Inibidores da sntese proteica
Existem vrios inibidores da sntese proteica. A puromicina provoca a concluso prematura da cadeia
pela entrada no local A e transferncia para a cadeia peptidil. Existem ainda inibidores dos ribossomas
nos procariotas, nomeadamente o cloranfenicol, que liga a subunidade grande e inibe a actividade da
peptidil transferase e a estreptomicina, a gentamicina e Kanamicina, que inibem a sntese proteica
atravs da ligao ao rRNA da subunidade pequena provocando erros de traduo na leitura dos codes
por causa de alteraes conformacionais no ribossoma. Em termos de inibidores da sntese proteica nos
eucariotas, encontramos a toxina diftrica, uma enzima produzida pela bactria C. Diphteriae que utiliza
cataliticamente o NAD para inactivar o eEF2 e a cicloheximida, que inibe o elongamento da cadeia
(competidor inibitrio da peptidil transferase).
Degradao proteica
Cerca de 30 % das protenas recm
sintetizadas so rapidamente
degradadas devido a erros. Contudo,
todas as protenas tm o seu turn-
over. A degradao proteica feita
nos lisossomas, ou, mais
frequentemente, mediada pelo
sistema ubiquitina-proteassoma,
degradando este sistema, as protenas
que se encontram no citoplasma. A
ubiquitina constituda por 76
aminocidos, que por vezes
denominada kiss of death, pois as
protenas poli-ubiquitinadas so
degradadas no proteossoma.
Os proteassomas funcionam como
trituradoras de papel - as protenas
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entram por um complexo de 19S, saindo por outro, os aminocidos livres. Como a acumulao de
protenas prejudicial para o organismo, pois leva a doenas neurodegenerativas, o proteossoma
desempenha um papel fulcral na clula. O proteossoma desempenha ainda funes importantes numa
variedade de processos celulares fundamentais tais como a regulao do ciclo, diviso, desenvolvimento
e diferenciao celular; apoptose; trfego celular e modulao das respostas imunes e inflamatrias.
Existem patologias, em que devido a mutaes, as protenas no conseguem sair da membrana
biolgica, acumulando-se no retculo endoplasmtico rugoso, onde so degradas pelo proteossoma.
Dado serem protenas necessrias para desempenhar funes biolgicas vitais, torna-se a importante,
atenuar a aco do proteossoma.






















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Controlo da expresso gnica e especializao celular
Todas as clulas de um dado organismo tm o mesmo DNA, que est contido no seu genoma, apesar de
clulas distintas produzirem diferentes protenas e terem diferentes regies do seu genoma activas.
Desse modo, compreende-se a importncia do controlo da expresso gnica, algo tambm constatado
atravs das nefastas consequncias registadas aquando de alteraes nessa regulao (que passam pelo
aparecimento de tumores, ou de patologias que surgem durante o desenvolvimento). A importncia do
controlo da expresso gentica ainda mais importante ao nvel dos procariotas, visto que estes
dependem deste processo para ir buscar ao meio aquilo que necessitam e, desse modo, sobreviver.
Existem cinco nveis de controlo da expresso
gnica ao nvel da trasncrio, do
processamento de mRNA, do transporte de
RNA, da traduo e do controlo da
actividade proteica. Contudo, o nvel de
controlo mais importante o primeiro, pois
permite poupar recursos energticos e tempo
(a clula evita, desde logo, a produo de
compostos desnecessrios).
Para a clula determinar quais os genes que deve transcrever, existe um promotor, activadores,
sequncias reguladoras e binding-proteins. Os repressores so molculas que se ligam a determinadas
zonas do DNA e reprimem a transcrio gentica. J os activadores ligam-se a zonas do DNA, permitindo
a activao da transcrio.
Regulao gnica nos procariotas
Nos procariotas a regulao da expresso gnica feita ao nvel da transcrio. A transcrio mediada
pelas interaces registadas entre o DNA e as protenas e pela RNA polimerase, funcionando, por isso,
os mecanismos de regulao de expresso gentico como interruptores genticos. A ttulo de
exemplo, podemos citar o opero da lactose, na E. coli.
Opero lac
Os genes includos no opero lac permitem a sntese de
enzimas que degradam a lactose, sendo uma forma de as
bactrias obterem glicose, aquando da sua falta. O opero
apresenta um promotor, um operador, genes lac e um
stio para a CAP. Ao promotor liga-se a RNA polimerase, ao
operador, o repressor e zona para a CAP, a CAP
(catabolite activator protein), uma protena activadora
dependente de cAMP e que vai favorecer a transcrio.
Aquando de elevadas concentraes de glicose e baixas de
lactose, a bactria no necessita de gastar energia a
produzir enzimas e a degradar a lactose. Dessa forma, um
repressor liga-se zona do operador, impedindo a RNA
polimerase, juntamente com o factor
70
de iniciar a
transcrio dos genes lac. O CAP tambm no se liga ao
seu stio respectivo nesta situao.
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Quando existem concentraes elevadas de glicose e de lactose, a bactria realiza transcrio dos genes
lac em baixa quantidade. A transcrio realizada porque a lactose liga-se ao repressor, impedindo-o de
se ligar ao operador (o que leva a que a RNA polimerase se ligue ao promotor e inicie a transcrio).
Contudo, a transcrio feita em nveis reduzidos, porque o CAP no se liga sua regio, pois este no
activado, devido s baixas concentraes de cAMP. Contudo, quando a concentrao de glicose baixa
e a concentrao de lactose elevada, ocorre a activao do CAP, pelo cAMP e a transcrio feita a
nveis elevados (o que compreensvel dada a situao do meio).
Regulao distncia
A regulao gnica nos procariotas tambm pode ocorrer distncia. A regulao da ligao
54
-RNA
polimerase levada a cabo pela NtrC (nitrogen regulatory protein C), que se liga a um enhancer. Os
dmeros fosforilados da NtrC encontram-se muito longe da regio do promotor, mas atravs da
formao de uma dobra conseguem contactar com a
54
-RNA polimerase.
Regulao gnica nos eucariotas
Nos eucariotas o processo mais complexo, devido estrutura da cromatina (nomeadamente, a
heterocromatina) e as sequncias activadoras tm um papel muito mais fulcral que as repressoras.
Existe tambm um nmero muito maior de sequncias reguladoras. Nos eucariotas, por fim, os
elementos regulatrios tanto se podem encontrar muito prximos, como muito longe dos locais de
iniciao de transcrio.
Dentro do grupo de sequncias
activadoras, destacam-se os
enhancers, regies de DNA, s
quais se ligam protenas, o que
leva a uma aumento exponencial
da taxa de transcrio (no
sendo, apesar disso, promotores).
Os factores de transcrio so activadores transcripcionais que se ligam ao DNA, nomeadamente aos
promotores e aos enhancers e que apresentam geralmente um domnio de ligao ao DNA (raramente
apresentam mais que um) e um ou vrios domnios de activao. Estes factores interagem com a RNA
polimerase II. A Gal4 um exemplo de um factor de transcrio na levedura.
Os repressores transcripcionais, por seu turno, apresentam uma estrutura similar aos activadores e a
ausncia da actividade repressora pode ter consequncias nefastas, por exemplo, a ausncia de
represso do gene EGR-1 no rim em desenvolvimento, leva ao desenvolvimento do tumor de Wilms.
As protenas activadoras e repressoras interagem com co-activadores (que aumentam a expresso de
um gene e co-repressores (que diminuem a expresso de um gene). O complexo mediador, formado
por uma cauda, uma cabea, uma regio mdia e um mdulo CDK, permite a interaco entre os
activadores e a RNA-polimerase, funcionando como um co-activador.
A combinao de vrias protenas activadoras e repressoras (ou seja, de vrias protenas reguladoras)
aumenta a variedade de controlo gentico, nomeadamente atravs da formao de complexos. Dessa
forma, a clula no necessita de ter um nmero infindvel de protenas reguladoras. Nestes complexos,
podemos ter protenas activadoras a participar em complexos de represso, contudo, elas continuam a
ser activadoras, no passam a ser protenas repressoras! O mesmo se passa com as protenas
repressoras, que integram complexos de activao, continuam a ser protenas repressoras. Os
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monmeros desses complexos so heterodmeros, num processo que se designa por combinao
heterodimrica dos factores de transcrio.
A cromatina tambm modulada aquando da transcrio de
genes, pois a sua condensao implica a ausncia de
transcrio, enquanto a sua descondensao est associada a
transcrio activa. Dessa forma, os repressores promovem a
deacetilao das histonas e metilao de algumas classes e a
sua, contribuindo assim para a formao de heterocromatina.
Por outro lado, os promotores promovem a acetilao das
histonas, bem como a metilao de algumas. A metilao
uma forma de silenciamento de certos genes, nos vertebrados.
Quando esse padro de metilao estabelecido, cada local
metilado passado para as clulas descendentes. Porm, na
verdade, para o gene estar completamente silenciado, segue-
se a ligao de protenas at regio metilada e a ocorrncia
de deacetilaes. O processo de imprinting ocorre com
silenciamento de um alelo proveniente de um progenitor,
atravs de metilaes e outras modificaes histnicas. Nos
indivduos do sexo feminino ocorre igualmente inactivao
aleatria de um cromossoma X, por condensao da sua
cromatina.
Mecanismos alternativos de controlo da expresso gnica
Mecanismos pr-transcripcionais e transcripcionais
Um processo de controlo de expresso gnica, ainda antes de ocorrer a transcrio, prende-se com a
insero de genes mveis (transposes) no meio de um gene que codifica uma protena, o que leva a
que se produza depois um mRNA ou uma protena no funcional. As protenas truncadas, por exemplo,
so protenas incapazes de desempenhar determinadas funes, porque lhes faltam resduos de
aminocidos
Hormonas esterides tambm podem assumir tambm uma funo vital enquanto reguladores da
expresso gnica, pois ligam-se a protenas receptoras que formam um complexo, que por sua vez se
liga ao DNA, permitindo a sua transcrio. A ausncia destas hormonas impede a ocorrncia de
transcrio.
Mecanismos ps-transcripcionais
Aps a transcrio, inmeros processos podem ocorrer no sentido de controlar a expresso gentica.
Contudo, estes processos so secundrios, quando comparados com os de controlo ao nvel da
transcrio.
Em primeiro lugar, a longevidade e estabilidade do mRNA pode ser alterada, havendo ligaes para
impedir a sua degradao. Por exemplo, aquando da amamentao, a prolactina liga-se ao mRNA da
casena, impedindo a sua digesto pela ribonuclease e permitindo a sua traduo em casena, protena
do leite. Isto no acontece, aquando da glndula mamria no-lactante.
O RNA editing consiste em alteraes da sequncia nucleotdica de mRNA, sendo estas feitas por
substituio (por exemplo, o gene APOB transcrito e traduzido no fgado sem sofrer editing, contudo,
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no intestino, o seu mRNA o codo CAA sofre editing e origina UAA, um codo stop, de modo a evitar a
sua traduo) ou por insero/deleco (como acontece com o gene de uma subunidade da oxidase do
citocromo c no Trypanosoma brucei).
O uso de RNA de interferncia (RNAi, ou RNA interference) um processo com bastantes aplicaes na
investigao cientfica e no qual um pequeno fragmento de RNA se vai hibridizar com o mRNA,
formando uma cadeia dupla de RNA. Esta reconhecida como anmalo pela clula e, por isso, vai ser de
imediato degradada, impedindo que o mRNA seja traduzido.
Tambm ao nvel do processamento pode
ocorrer controlo da expresso gnica. O
splicing uma etapa do processamento, na
qual so removidos intres e unem-se os
exes. Atravs do processo de splicing
alternativo, podemos combinar vrias
sequncias de exes e um fragmento gentico
pode originar vrias protenas diferentes,
permitindo que com se origine um nmero de protenas superior ao nmero de genes existentes. O
splicing alternativo permite ento que um mesmo pr-mRNA origine, quer um activador, se for
integrado um exo que codifica uma regio de activao, ou um repressor, se essa regio no for
integrada.
Existem ainda mecanismos de represso da traduo do mRNA, em que as protenas no so
traduzidas, ou no sofrem alteraes ps-tradues, que lhes seriam vitais para assumirem as suas
funes.














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Membranas biolgicas
As membranas biolgicas so estruturas com uma espessura que varia entre 5 e 9 nanmetros e que
separam o contedo de organelos, ou da prpria clula, do meio exterior, permitindo delimitar essas
estruturas. O ncleo e as mitocndrias tm uma dupla membrana e o lmen do retculo endoplasmtico
rugoso separado do citosol tambm por uma membrana biolgica.
As membranas biolgicas, cuja principal funo a de isolamento, so formadas por uma dupla camada
fosfolipdica e por protenas que se podem ancorar membrana ou atravess-la.
Dupla camada fosfolipdica
Os fosfolpidos so constitudos por cabeas polares e hidroflicas, constitudas por colina, serina ou
etanolamina, fosfato e glicerol e por caudas hidrofbicas, constitudas por cidos gordos, sendo por isso
designadas por molculas anfipticas.
As molculas polares so hidroflicas, visto que nelas ocorre distribuio de cargas e, por isso, quando
entram em contacto com a gua, as cargas positivas interagem com o oxignio e as cargas negativas
com o hidrognio (a gua , ela prpria, uma molcula polar).
J nas molculas apolares, como no ocorre distribuio das cargas elctricas, no existe um diplo.
Dessa forma, essas molculas no interagem com as molculas de gua, que preferem interagir umas
com as outras. Diz-se que so molculas hidrofbicas.
Dessa forma, os lpidos, quando colocados em gua podem-se arranjar formando micelas, no caso de
terem uma estrutura em cunha, sendo que as partes hidroflicas ficam em contacto com a gua, ou
bicamadas, como no caso dos fosfolpidos. Contudo, a bicamada fosfolipdica obrigada a fechar, por
aco de foras hidrofbicas, formando uma estrutura esfrica.

Fosfolpidos das membranas
Existem quatro fosfolpidos integrantes das membranas biolgicas. So eles a fosfatidiletanolamina, a
fosfatidilserina, a fosfatidilcolina e a esfingomielina.
A fosfatidiletanolamina um fosfolpido existente no folheto interno da bicamada, sendo formada por
etanolamina, fosfato, glicerol e dois cidos gordos. A etanolamina tem uma carga positiva e o fosfato
tem uma carga negativa, o que leva a que a carga geral da fosfatidiletanolamina seja nula.
A fosfatidilserina um fosfolpido existente no folheto interno da bicamada, sendo formada por serina,
fosfato, glicerol e dois cidos gordos. A serina tem uma carga positiva e uma negativa e o fosfato tem
uma carga negativa, o que leva a que a fosfatidilserina tenha carga negativa. Isto revela-se uma
caracterstica essencial em termos de sinalizao.
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
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A fosfatidilcolina um fosfolpido existente no folheto externo da bicamada, sendo formada por colina,
fosfato, glicerol e dois cidos gordos. A colina tem uma carga positiva e o fosfato tem uma carga
negativa, o que leva a que a carga geral da fosfatidilcolina seja nula.
A esfingomielina um fosfolpido existente no folheto externo da bicamada, sendo formada por colina,
fosfato, esfingosina e dois cidos gordos. A colina tem uma carga positiva e o fosfato tem uma carga
negativa, o que leva a que a carga geral da esfingomielina seja nula. A esfingomielina o nico
esfingolpido constituinte das membranas biolgicas. Todos os restantes so fosfoglicerdeos.
Existe ainda um quinto fosfolpido constituinte da membrana, embora presente em baixas
concentraes o fosfatidilnositol. Este encontra-se no folheto interno da bicamada, sendo formado
por inositol, fosfato, glicerol e dois cidos gordos. uma molcula com uma carga negativa, o que lhe
confere propriedades de sinalizao.
Formao de membranas biolgicas
Os fosfolpidos constituintes das membranas
biolgicas so formados no folheto interno do
retculo endoplasmtico rugoso, ocorrendo a adio
de fosfolpidos com o contributo da enzima
scramblase, uma enzima no especfica, que
permite que o nmero de fosfolpidos fique igual em
ambos os folhetos. A membrana produzida no
retculo ento exportada por exocitose. Contudo,
esta ainda no assimtrica, ou seja ainda no h
uma distribuio dos diferentes tipos de fosfolpidos
pelos respectivos folhetos. Essa distribuio levada
a cabo pela enzima flippase, uma enzima especfica
que permite tambm os movimentos de flip-flop nas
membranas.
Movimentos ocorridos ao nvel das membranas biolgicas
A membrana biolgica uma estrutura fluida os fosfolpidos realizam fcil e espontaneamente
movimentos laterais e de rotao. Contudo, a mudana de camada pelos fosfolpidos (movimentos de
flip-flop) no se realiza dessa maneira fcil e espontnea, mas sim conta da flippase e da scramblase.
Isto leva a que esses movimentos ocorram
muito menos frequentemente que os
restantes.
Existem factores, contudo, que contribuem
para variaes na fluidez da membrana. Um
deles prende-se com a saturao das cadeias
fosfolipdicas cadeias insaturadas levam
formao de membranas mais fluidas,
enquanto cadeias saturadas levam formao
de membranas mais rgidas. Isto acontece,
porque quando as cadeias de fosfolpidos
esto insaturadas, formam uma dobra, qual se d o nome de kink. Isto faz com que quando temos
vrias cadeias insaturadas, haja um maior espao entre os fosfolpidos e a espessura da membrana seja
menor. Este mecanismo descrito utilizado por bactrias para efeitos de termorregulao.
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
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Tambm a presena de colesterol influencia a fluidez das membranas. O colesterol um esteride que
preenche os espaos entre os fosfolpidos. O seu anel esteride torna o rgido, levando a que a
mobilidade dos fosfolpidos fique reduzida, bem como a permeabilidade da membrana. Contudo, o
colesterol pode actuar tambm no sentido de prevenir a cristalizao da membrana.
Por fim, o tamanho das cadeias de cidos gordos tem forte influncia na fluidez das membranas
cadeias maiores resultam em menor fluidez e cadeias menores resultam em maior fluidez.
Sinalizao celular por aco dos fosfolpidos
Os fosfolpidos com carga negativa tm um importante papel em termos de sinalizao celular. Por
exemplo, quando a clula vai entrar em apoptose, a aco da flippase diminui e a da scramblase
aumenta. Isto leva a que a fosfatidilserina migre para o folheto externo da membrana celular, onde
reconhecida por macrfagos, levando apoptose da clula.
O fosfatidilinositol, por seu turno, importante para a activao da cnase do fosfatidilinositol (PI 3
kinase) ou fosfolipase C, sendo um mensageiro intracelular de importncia considervel.
Glicolpidos
Os glicolpidos esto presentes no folheto externo das membranas biolgicas. Tm associados
oligossacardeos a lpidos e como funes a proteco celular e intervir na interaco inter-celular.
Protenas membranares
As membranas biolgicas tm-lhes associadas diversas protenas membranares. Estas podem ser
integrais, caso atravessem a membrana ou lhe estejam ancoradas, por uma ligao muito forte (por
exemplo, covalente), ou perifricas, caso a ligao que tenham membrana no seja muito forte. As
protenas membranares so muitas vezes receptores, transportadores ou canais inicos, embora
tambm possam desempenhar funo enzimtica, ou de traduo de sinais.
As protenas transmembranares so molculas anfipticas, contactando as
regies hidroflicas (que so constitudas por aminocidos hidorflicos) com
o meio aquoso e as regies hidrofbicas (que so constitudas por
aminocidos hidrofbicos) com as regies hidrofbicas das membranas.
Essas protenas podem atravessar uma vez a membrana sob a forma de uma
hlice , que tem entre 20 a 30 aminocidos hidrofbicos (a glicoforina A
uma protena dos eritrcitos que s atravessa a membrana uma vez e tem
estrutura em hlice ) , ou vrias vezes, sob a forma de sucessivas hlices
(a ttulo de exemplo, possvel citar a bacteriorodopsina, que atravessa a
membrana sete vezes, sendo uma bomba transportadora de protes). As
folhas tambm podem atravessar a membrana biolgica, formando
estruturas tipo canal (como exemplo, temos as porinas, protenas com
vrias passagens transmembranares, que so canais presentes na
membrana plasmtica externa da E.coli). J as protenas ancoradas podem
se ligar membrana por pontes de oligossacardeos.



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Transporte transmembranar
As membranas biolgicas podem ser atravessadas por molculas por difuso simples ou por processos,
nos quais intervm protenas mediadoras, nomeadamente a difuso facilitada e o transporte activo.
Tipo de transporte Molculas transportadas Via de transmisso A favor do
gradiente
Selectivo
Difuso simples Gases, molculas hidrofbicas
e pequenas molculas polares
Dissoluo na membrana
transportadora

Difuso facilitada Grandes molculas polares e
molculas com carga
Canais inicos e transportadores
passivos

Transporte activo Solutos contra o gradiente de
concentrao

Transportadores activos (bombas)




Difuso simples
O processo de difuso simples no
requer a presena de qualquer
protena. , portanto, um processo
no-mediado em que gases,
molculas apolares e pequenas
molculas polares (tais como gua e
etanol, embora a probabilidade de
estas molculas atravessarem a
membrana biolgica seja menor)
atravessam a membrana por
dissoluo na bicamada fosfolipdica,
algo que ocorre sem dispndio
energtico, visto que este processo ocorre a favor do gradiente de concentrao. De referir que, dadas
as caractersticas deste processo, este considerado no selectivo.
Transportadores e canais inicos
Os canais inicos so protenas incorporadas na membrana, que abrem um caminho aquoso nesta. O
contacto com a bicamada fosfolipdica feito atravs de aminocidos hidrofbicos, enquanto, a zona de
abertura est revestida por aminocidos hidroflicos. Estes canais nem sempre esto abertos e
participam em processos de difuso facilitada.
Os transportadores proteicos, por seu turno, nunca abrem por completo Abrem-se de um lado,
permitindo a ligao do soluto e, fechando-se nesse lado, abrem-se no outro, permitindo a sada de
soluto. A sua presena nas membranas biolgicas tambm obriga a que apresentem aminocidos
hidrofbicos, para contactar com a bicamada fosfolipdica, e hidroflicos, para contactar com a regio
aquosa. Os transportadores proteicos podem participar no processo de difuso facilitada, sendo a
denominados por transportadores passivos, e no processo de transporte activo, sendo a denominados
por bombas. Ambos os tipos de transportadores esto sujeitos a alteraes conformacionais.
Em termos de rapidez, podemos afirmar que os canais inicos so 100 000 vezes mais rpidos que os
transportadores.

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Difuso facilitada
O processo de difuso facilitada permite a passagem de molculas polares a favor do gradiente
electroqumico (o processo de difuso simples ocorre unicamente a favor do gradiente qumico, uma
vez que as molculas que atravessam esta membrana por este processo so apolares) e, como tal, sem
dispndio energtico. Este um processo selectivo, que mediado por protenas (transportadores e
canais inicos).
Transporte activo
O processo de transporte activo permite a passagem de solutos contra o gradiente de concentrao,
algo que ocorre conta do consumo de energia, sendo um processo selectivo. Esta energia pode partir
da hidrlise do ATP, bem como da acoplao de um processo de transporte a favor do gradiente
electroqumico ao processo de transporte contra o gradiente. Algumas bactrias utilizam tambm a luz
para permitir a passagem de solutos contra o gradiente de concentrao.
Relativamente aos tipos de
transportadores, temos uniportes, se
apenas transportarem um soluto numa
nica direco; simportes, se
transportarem dois solutos numa
mesma direco e antiportes se
transportarem quase simultaneamente
dois solutos em direces diferentes.
Aquando da entrada de glicose nos
entercitos, verificamos que esto envolvidos os trs tipos de transportadores como a glicose existe
em maior concentrao no interior do entercito, que no lmen intestinal, esta entra para o entercito
por via de um simporte, visto que o processo de entrada desta ose est acoplada entrada de Na
+
. A
sada da glicose do entercito feita por difuso facilitada, atravs de um uniporte, pois a concentrao
de glicose maior dentro do entercito que no fluido extracelular. Finalmente, possvel manter o
gradiente de sdio, atravs da bomba de sdio e potssio, que um antiporte.
O funcionamento do simporte da glicose explica-se pelo princpio da cooperatividade (que ocorre
quando uma molcula facilita a passagem de outra) 2 Na
+
ligam-se em primeiro lugar ao
transportador, o que aumenta a
afinidade deste para a glicose,
permitindo a sua entrada e ligao
ao receptor. Depois, os 2 Na
+

saem do transportador, o que
diminui a afinidade do
transportador glicose e permite
a sua sada.
Relativamente bomba de sdio
e potssio, esta tem uma grande
afinidade para o Na
+
, de tal modo
a que este se liga a este
transportador. A bomba ento
fosforilada, por via da hidrlise do
ATP, o que altera a conformidade do transportador, diminuindo a sua afinidade para o Na
+
, que se
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desliga deste. Por consequncia, a afinidade ao K
+
aumenta, permitindo o seu transporte por processos
similares. De referir que este transportador bombeia para fora da clula 3 Na
+
, entrando 2 K
+
. Tambm o
transporte de Ca
2+
(que tem de ser mantido a concentraes baixssimas) e H
+
feito conta do
gradiente de Na
+
.
Tipos de canais inicos
Comum a todos os canais inicos a presena de filtros selectivos para ies, nomeadamente o Na
+
, o
K
+
, o Ca
2+
e o Cl
-
, sendo que alguns so activados por um estmulo especfico e outros se encontram
permanentemente num estado intermitente (alternando entre aberto e fechado).

Os canais inicos de fuga so canais de K
+
, que no so activados por nenhum estmulo especfico,
estando a sua funo relacionada com a gnese do potencial de repouso (-70 mV) na membrana,
atravs da sada dos ies K
+
do meio intracelular.
Existem ainda canais inicos activados por voltagem, cujo funcionamento se baseia em alteraes da
polarizao da membrana. Os canais de Na
+
so essenciais para gerar o potencial de aco e so
activados por despolarizao da membrana, mais propriamente por um potencial de -50 mV. J os
canais de K
+
delayed-rectifier so activados novamente por despolarizao da membrana, mas desta
vez, por um potencial de -20 mV, permitindo a sada do K
+
das clulas e a repolarizao (regresso ao
potencial de repouso).
Os canais inicos activados por transmissor podem ser de dois tipos canais inicos activados por
transmissor (extracelulares), ou canais inicos activados por ligandos intracelulares. Os primeiros
envolvem a ligao de molculas extracelulares ao transportador, permitindo a sua abertura. A ttulo de
exemplo, podemos citar o estmulo feito pelo glutamato aos canais de Na
+
e K
+
e que ser essencial para
se realizar a sinapse, pois permite alterar o potencial de repouso do neurnio ps-sinptico. Tambm o
GABA (cido -aminobutrico) pode se ligar a canais de Cl
-
, funcionando como um potencial inibitrio
ps-sinptico.
Relativamente aos canais inicos activados por ligandos intracelulares, o mecanismo idntico. A
ligao de molculas ou ies intracelulares ao receptor permite a sua activao. O Ca
2+
intra-celular, por
exemplo, pode-se ligar a canais de K
+
Ca
, permitindo a regulao do disparo neuronal.
Os canais inicos activados por estmulo mecnico so canais de caties, cuja funo a transformao
do estmulo mecnico em resposta elctrica.
As junes de hiato, tambm designadas por canais gap-junction, so canais de pequenos ies que
existem no epitlio, no endotlio e em clulas cardacas. Estas permitem fazer junes entre
membranas, permitindo a comunicao e sincronizao celular. No so estimuladas, mas podem ser
Canal Estmulo Tipo de canal Funo
Canal inico de fuga No apresenta Canal de K
+
Gnese do potencial de repouso
Canal inico activado por
voltagem
Despolarizao (-50 mV) Canal de Na
+
Despolarizao no potencial de aco
Despolarizao (-20 mV) Canal de K
+
Repolarizao no potencial de aco
Canal inico activado por
transmissor

Transmissor extracelular

Canais de ies
vrios

Funes ao nvel da transmisso do
impulso nervoso
Ligando intracelular
Canal inico activado por
estmulo mecnico
Mecnico/ presso Canal de
caties
Transformao do estmulo mecnico
em resposta elctrica
Junes de hiato No apresenta (s
modulao)
Canal de ies
pequenos
Ligao intercelular e sincronziao
da actividade celular
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moduladas, isto , quando a clula entra num estado indesejado (por exemplo, a sua concentrao de
Ca
2+
aumenta muito), o transportador fecha.
Canal de Na
+
dependente de voltagem
Este canal importante na gnese de
um potencial de aco, sendo que o
potencial de -50 mV contribui para a
sua activao. O seu estado activado
estado aberto, permitindo a
entrada de Na
+
na clula. Contudo,
1ms depois, este transportador fecha,
pois na regio voltada para o citosol,
liga-se uma bola de inactivao, que
forma espcie de um tampo. Quando ocorre repolarizao da membrana, o canal volta sua
conformao inicial.
O canal de Na
+
constitudo por quatro subunidades que se repetem, sendo que cada repetio
constituda por seis segmentos transmembranares, sendo que a sensibilidade a alteraes de polaridade
da membrana feita por um sensor de voltagem presente no segmento 4. Entre o quinto e o sexto
segmento existe um fortssimo
loop, correspondente ao poro do
canal, sendo por isso formado
por aminocidos hidroflicos.

Funcionamento dos canais de Na
+
e K
+
O Na
+
apenas atravessa o canal de Na
+
, se estiver ligado a uma molcula de gua. Caso contrrio, o K
+
,
como tinha carga igual ao Na
+
tambm poderia atravessar esse canal. A entrada de K
+
associado a uma
molcula de gua
impossvel, porque as
dimenses da abertura do
canal so menores que as
da H
2
O + K
+
. O K
+
tambm
no atravessa sozinho o
canal inico, porque a
energia necessria para o
K
+
se dissociar da
molcula de gua no
compensa a energia
ganha associada
passagem do
transportador.
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Por outro lado, o K
+
para atravessar o seu canal inico, realiza sozinho essa passagem, dissociado da
molcula de H
2
O. De seguida, o K
+
liga-se a oxignios de grupos carbonilo existentes no canal,
atravessando-o. J o Na
+
no consegue atravessar o canal, visto que, dissociado da molcula de gua
demasiado pequeno e no se consegue ligar aos oxignios dos grupos carbonilo (e dessa forma a
energia necessria para dissociar o Na
+
molcula de gua no compensa a energia associada
passagem do canal). O Na
+
tambm no consegue atravessar o canal inico associado a uma molcula
de gua dado as dimenses serem superiores s da abertura do canal.
















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Traduo elctrica de estmulos: Membrana Neuronal
O elemento bsico do sistema nervoso central o neurnio, uma clula especializada na recepo,
conduo e transmisso de sinais. Os neurnios podem ser de vrios tipos motoneurnios (neurnios
longos com um axnio mielnico e muitas dendrites), interneurnios (neurnios de menor comprimento
e sem o axnio mielnico) e neurnios sensoriais. Comum a todos os tipos de neurnios supracitados a
presena de um axnio, de um corpo, de dendrites e de botes sinpticos, permitindo estas duas
ltimas componentes, a transmisso de um estmulo nervoso para outro neurnio, atravs de uma
sinapse.

A membrana neuronal, para alm da bicamada lipdica, apresenta vrios tipos de canais inicos,
nomeadamente bombas de sdio e potssio, canais de fuga de K
+
, canais activados por glutamato
(transmissor excitatrio), canais de Na
+
dependentes de voltagem e canais de K
+
delayed-rectifier.
Potencial de repouso caracterizao e gnese
Os valores de potencial de aco e potencial de repouso (-70 mV) no so atribudos arbitrariamente,
mas calculados atravs da equao de Nernst, que dada pela frmula

, sendo F a constante
de Faraday, T, a temperatura, [X]
E
, a concentrao extracelular de um dado io e [X]
I
, a concentrao
intracelular de um dado io. Considerando que T = 36C, temos que

. Dessa forma, podemos


calcular o potencial de potssio (V
K
), que nos pode dar uma aproximao ao valor de potencial de
repouso:



Ora, sabemos que V
R
(valor de repouso) no igual a V
K
, como seria de esperar, mas assume o valor de
-70 mV. Isto porque a membrana tambm permevel a outras cargas. Como [Na
+
]
E
+ [K
+
]
E
= 150 mM e
[Na
+
]
I
+ [K
+
]
I
= 150 mM, fazendo as contas temos que o valor de equilbrio para o total das cargas de
sdio e potssio de 0 mV.
A partir do valor de -70 mV, dizemos que ocorre despolarizao, se o valor de V
R
se torna cada vez
menos negativo ou mais positivo (e portanto diminui a polarizao da membrana), ou hiperpolarizao,
quando o seu valor se torna cada vez mais negativo, (ou seja, aumenta a polarizao da membrana). De
referir que o potencial da membrana nunca chega a ser zero, porque o nmero de ies envolvidos,
aquando de um estmulo, nunca suficiente para tal.
No fluido extracelular, a concentrao de Na
+
de 145 mM fora da clula e a de K
+
de 5 mM. Ora, se
no existisse a bomba de sdio e potssio, a concentrao destes ies seria igual quer no exterior, quer
no interior nas clulas. Dessa forma, o sdio expulso da clula e o potssio entra para esta, pela
bomba de sdio e potssio.
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Contudo, a bomba de sdio e potssio no suficiente para gerar um potencial de membrana. O
potencial de repouso (polarizao da membrana) gerado ainda pelos canais de fuga, atravs dos quais
o K
+
sai a favor do gradiente de concentrao (arrastando consigo uma carga positiva para fora da
clula), atingindo-se o equilbrio quando o gradiente electroqumico zero (ou seja, quando o gradiente
qumico igual ao gradiente elctrico, isto , o nmero de ies que sai a favor do gradiente qumico
igual ao nmero de cargas que entra por potencial elctrico).
Potencial de aco
A presena de canais de Na
+
e K
+
activados por glutamato so essenciais para se dar a estimulao
sinptica, ou seja, para a gnese de um potencial ps-sinptico excitatrio (EPSP), que vai despoletar a
despolarizao da membrana. Quando se atinge -50 mV, ou seja, quando a entrada de Na
+
para a clula
excede a sada de K
+
, diz-se que atingido o limiar do potencial de aco.
Quando se atinge o limiar do potencial da aco, so activados os canais de Na
+
dependentes de
voltagem. Estes canais existem quase em exclusivo no axnio, pois nos restantes locais do neurnio, a
densidade deste tipo de canais muito baixa. A activao dos canais de Na
+
dependentes de voltagem,
leva a que os ies de Na
+
entrem no meio intracelular, permitindo membrana atingir o potencial de
equilbrio para o Na
+
(o que significa que a quantidade destes canais no axnio muito grande). Ao fim
de 1 ms, os canais de Na
+
so inactivados pelas bolas de inactivao, impedindo a passagem de mais
ies Na
+
.
Segue-se o processo de repolarizao. Se apenas tivssemos canais de fuga de K
+
, a repolarizao
demoraria centenas de milissegundos, da a existncia de canais de K
+
dependentes de voltagem. Estes
canais demoram 1 ms a abrir (e da tambm serem chamados de delayed-rectifier), por isso a sua
activao ocorre, quando a polarizao da membrana atinge os -20 mV. Dessa forma, os canais K
+

dependentes de voltagem apenas abrem, quando os de Na
+
fecham. A densidade dos canais de K
+
dependentes de voltagem muito elevada e permitem, juntamente com os canais de fuga, que a
polarizao da membrana
chegue ao valor de
equilbrio para o potssio.
Contudo, no final, vo ser
esses mesmos canais de
fuga, que vo levar ao
regresso da membrana ao
valor do potencial do
repouso (-70 mV).
importante mencionar que
a quantidade de ies que
atravessa os canais
reduzida e que, portanto, as
concentraes de sdio e
potssio, quer no interior da
clula, quer no meio
extracelular, praticamente
no sofrem alteraes. Isto
constitui uma vantagem, na
medida em que os gastos de
energia sob a forma de ATP
necessrios para a bomba
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de sdio e potssio restabelecer as concentraes normais de sdio e potssio so, deste modo,
muito reduzidos.
De referir que o potencial de aco inicia-se no cone axonal (zona mais proximal do axnio, em que este
contacta com o corpo do neurnio), visto que l que a densidade dos canais de Na
+
activados por
voltagem maior. Depois, a propagao do potencial de aco feita num sentido unidireccional, pois
concomitantemente aos circuitos elctricos associados transmisso do potencial de aco, ocorrem
pequenas despolarizaes da membrana nos canais adjacentes ao canal de Na
+
em que est a haver
passagem de ies (ou seja, que est aberto e activado). O canal que est imediatamente depois ento
activado e o que est imediatamente antes no afectado, porque j est inactivado (da a importncia
dos canais de Na
+
activados por voltagem ficarem inactivos aps 1 ms).
A bainha de mielina funciona como um isolante e baixa a capacidade da membrana do axnio, porque a
torna mais espessa. Os ndulos (ou ns) de Ranvier interrompem a bainha de Mielina e permitem uma
propagao saltatria do potencial de aco, pois neles esto presentes canais de Na
+
activados por
voltagem em elevadas concentraes.
Sinapse qumica
O processo de sinapse qumica permite que o estmulo
propagado num neurnio, designado por pr -sinptico,
continue a ser propagado num outro neurnio, designado
por ps sinptico. Durante a sinapse ocorre a libertao de
neurotransmissores na fenda sinptica, estando estes
transmissores inicialmente envoltos por vesculas sinpticas,
que depois se fundem com a membrana do neurnio pr-
sinptico. Este processo ocorre devido entrada de Ca
2+
na
membrana pr-sinptica, atravs de canais de Ca
2+

dependentes de voltagem, pois o Ca
2+
permite a fuso das
vesculas sinpticas com a membrana pr-sinptica.
O transmissor libertado vai ento activar o transmissor dos
canais inicos na membrana ps sinptica, sendo depois
removido da fenda sinptica pelos processos de reuptake
(reentrada do neurotransmissor para o neurnio pr-
sinptico, algo que permite a reciclagem dos neurotransmissores) e de difuso para o meio.
Potencial ps-sinptico inibitrio
O potencial ps-sinptico no sempre excitatrio (EPSP), este tambm pode ser inibitrio (IPSP) e,
nesse caso, o potencial activado por GABA (cido aminobtrico gama) ou por glicina, sendo abertos
os canais destas substncias, que so canais de cloro. Isto leva entrada de cloro na clula, que, dado
ser um anio, vai levar a que ocorra uma hiperpolarizao da membrana. Podem ser transmitidos
simultaneamente, um potencial inibitrio e um excitatrio, levando anulao dos efeitos.

Somatrio dos potenciais ps-sinpticos
Dizemos que temos sinapses iguais, quando no local em que se gera EPSP, o potencial ps-sinptico
igual. Contudo, isto no significa que num mesmo local essas duas sinapses no tenham potenciais ps-
sinpticos diferentes. Considerando que ocorreram sinapses iguais, mas que uma ocorreu mais proximal
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(ou seja, que ocorreu mais prxima
do corpo do neurnio),
relativamente a outra, temos que,
no local do cone axonal (ou noutro
qualquer ponto do axnio) a
sinapse distal vai chegar com um
potencial ps-sinptico menor que
a proximal. Da ser feito os
somatrios espacial e temporal dos potenciais ps sinpticos, para um determinado local, sendo que o
somatrio temporal tem em conta o tempo de atraso da sinapse distal.
A intensidade de um potencial ps-
sinptico pode ser traduzida em
frequncia, dessa forma, quanto mais
intenso este for, maior a frequncia
associada a este potencial. Esta relao
e entendida como o output do
neurnio. O patch clamp uma tcnica
que permite estudar estmulos
nervosos, nomeadamente o que se
passa ao nvel dos canais inicos,
registando-os sob a forma de grfico e
permitindo analisar as diferenas entre
os valores tericos calculados e os
valores que ocorrem de facto.













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Modelos experimentais de controlo da expresso gentica
Ao nvel da expresso gentica podemos ter situaes em que verificamos que houve uma perda de
funo e outras em que se regista um ganho de funo. Entende-se por perda de funo (loss of
function LOF), uma mutao que resulta numa funo proteica reduzida ou abolida e esta pode
ocorrer por via da ablao do gene que para esta codifica, pela induo da degradao do mRNA ou pela
prpria inactivao da protena. J o processo de ganho de funo (gain of function GOF), que ocorre
muito mais raramente, ocorre uma mutao que confere uma actividade anormal numa protena,
podendo esta ocorrer por via da expresso ectpica de uma protena (ou seja, em locais onde esta no
normalmente expressa).
Em laboratrio interessa induzir losses of function e gains of function, de forma a estudar as funes dos
genes, nomeadamente o seu papel em termos de patologias, e para isso recorre-se ao DNA
recombinante para introduzir ou suprimir um gene, ao RNA de interferncia para silenciar o mRNA
produzido e a sequestrao por anticorpos ou por protenas recombinantes para actuao em
protenas. Estes testes podem-se realizar in vitro, caso sejam levados a cabo em clulas em cultura, ou in
vivo, caso sejam realizados em modelos animais, cujos mais comuns se encontram no quadro em baixo
(de notar as semelhanas embriolgicas):

Tcnica de electroporao
A tcnica de electroporao consiste na introduo de DNA recombinante em clulas, atravs da
aplicao de um breve choque elctrico de milhares de volts. Isto torna as clulas temporariamente
permeveis ao DNA, permitindo realizar experincias LOF, nas quais introduzimos um RNA de
interferncia que silencia um determinado mRNA, ou GOF, por sobrexpresso ectpica de uma protena.
Em muitos tecidos, nomeadamente a espinal medula, procede-se introduo do DNA recombinante de
um dos lados, ficando o outro intacto, como regio de controlo.


Bernardo Manuel de Sousa Pinto
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
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68

Animais geneticamente modificados
A modificao gentica de animais j uma realidade e tem mltiplas aplicaes, nomeadamente no
campo da sade.
Transgnicos
Animais transgnicos so animais cujo material gentico foi alterado, atravs de tcnicas de engenharia
gentica. Para produzir um animal transgnico deve-se produzir um vector (nomeadamente um
plasmdeo), contendo o gene de interesse e um gene que permita que a produo da protena
codificada pelo gene de interesse ocorra num tecido particular (quando se utilizam cabras ou ovelhas,
por exemplo, til que a produo dessa protena ocorra ao nvel do leite). O vector ento introduzido
em zigotos, que, por sua vez, so colocados no tero de um indivduo do sexo feminino (a foster
mother). Os indivduos que se desenvolvem a partir dos zigotos so transgnicos e produzem a protena
codificada pelo gene de interesse.
Os ratinhos so animais, cujo genoma frequentemente modificado. Vamos tomar o exemplo dos
ratinhos fluorescentes estes exprimem a GFP e o DNA que codifica para esta colocado por
microinjeco num dos proncleos
(um ncleo de um dos gmetas,
depois do espermatozide ter
entrado no vulo, mas antes de
ambos os ncleos gamticos se
juntarem). Depois, os zigotos que
sobrevivem manipulao (entre 10
e 30%) so transferidos para uma
foster mother, sendo que entre 10 e
30% da descendncia tem o DNA
integrado no seu genoma (esta
ocorre de forma aleatria), ou seja,
neste caso, exprime a GFP. Os
indivduos que exprimem o gene em
questo so ento cruzados, de
forma a originar descendncia que
tambm o exprima.
Bernardo Manuel de Sousa Pinto
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69

Ratinhos KO
A produo de ratinhos knockout permite a produo
de indivduos que apresentam genes que esto
inactivos no organismo. Esta faz-se conta de gene
targeting, uma tcnica na qual levada a cabo a
introduo de genes mutados (genes com uma
determinada insero no meio) numa clula-tronco
embrionria por electroporao (num processo, cuja
eficincia ronda os 5%). Estes passam a integrar o
contedo cromossmico das clulas-tronco, atravs de
recombinao homloga, ocorrendo isto uma vez em
cada 10
5
clulas estaminais transfectadas. As clulas
embrionrias contendo a mutao knockout so ento
introduzidas no embrio de um ratinho, sendo os
descendentes gerados, quimeras (uma quimera um
animal que tem duas ou mais populaes diferentes de
clulas geneticamente distintas).
As quimeras so ento cruzadas com indivduos wild-
type (normais), levando formao de descendncia
normal e heterozigticos para o gene knockout. Os
indivduos heterozigticos so ento cruzados, levando
produo de indivduos knockout, wild-type e
heterozigticos. De referir que, os indivduos
heterozigticos so mantidos, pois os ratinhos
knockout no tm grande viabilidade reprodutiva,
contrariamente aos heterozigticos.
A produo de indivduos knockout essencial para o estudo de patologias, como o piebaldismo,
malformaes originadas pela deficincia no gene KIT.
Sistema Cre-Lox
O sistema Cre-Lox permite a produo de indivduos transgnicos modificados, ou seja, que exprimem
um dado gene em apenas determinados tecidos. Dessa forma, utilizamos um indivduo com o promotor
de um tipo especfico de uma clula e com o gene que codifica a enzima Cre-recombinase (abreviada
como Cre), que posto a cruzar com outro que apresenta o gene de interesse ladeado por dois loci Lox
P (sequncias de nucletidos, iguais de ambos os lados que flanqueiam o exo em questo).
A descendncia apresenta clulas onde se manifesta o gene de interesse (aquelas onde est presente a
protena Cre e que correspondem s clulas-alvo do promotor) e clulas normais, onde no est
presente a protena Cre.



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70

RNA de interferncia
O RNA de interferncia (RNAi) um processo que consiste na induo da formao de regies de cadeia
dupla de mRNA que so degradadas pela clula. Este pode ser levado a cabo atravs dos MicroRNAs e
do siRNA. Estes permitem ento o silenciamento da expresso de alguns genes, algo que pode ser til
no tratamento contra o cancro. Para alm disso, o uso de siRNA em linhagens celulares eficiente e
facilmente controlvel e exequvel.
MicroRNAs
Os microRNAs desempenham importantes funes nos genes humanos estimando-se que cerca de
30% destes so controlados por miRNAs (conhecem-se actualmente mais de 400 genes humanos
regulados por miRNAs). Para alm disso, 80% dos miRNAs so especficos para determinados tecidos.
Os micro-RNAs apresentam em mdia 22 ribonucleotdeos e so transcritos a partir de genes prprios
ou de intres, atravs da RNA polimerase II ou III. Uma vez no citosol, os miRNAs ligam-se a mRNAs alvo,
formando regies de cadeia dupla, que so degradadas, ou cuja traduo silenciada.
In vitro possvel a sntese de small hairpin RNAs, que mimetizam os micro-RNAs endgenos.
siRNA
Para levar a cabo o mecanismo de siRNA, comea-se por se introduzir na clula uma longa cadeia de
dsRNA (double-stranded RNA - RNA em cadeia dupla). Esta clivada em siRNAs (short interfering RNA)
pela enzima dicer, apresentando cada siRNA cerca de 20 nucleotdeos. Alternativamente, possvel a
sntese de siRNAs fora da clula e posterior introduo desta estrutura no meio intracelular.
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71

A protena Ago (Argonaute) procede ento clivagem de
uma das cadeias de cada siRNA, algo feito com gastos de
ATP. Isto activa o RISC (RNA-inducing silencing complex) e
permite a ligao do siRNA ao mRNA alvo, formando uma
estrutura de cadeia dupla, que logo degradada.
O RNA antisense funciona de um modo similar ao siRNA,
contudo, introduzida uma cadeia simples de RNA,
complementar a uma cadeia de mRNA, qual ela se vai
ligar, impedindo assim que ocorra traduo.
Desafios para a medicina
Apesar das vantagens do uso de partculas recombinantes,
existe ainda um grande obstculo sua aplicao em
grande escala, no tratamento de doenas, em medicina e
que se prende com o como fazer as partculas
recombinantes chegar aos tecidos onde estas devem
actuar.
No podemos aplicar choques elctricos e introduzi-las por electroporao, nem criar linhas de seres
humanos transgnicos. Os meios de administrao mais viveis prendem-se ento com a utilizao de
vrus, com o contedo gentico em causa, ou lipossomas.











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Citosqueleto - Actina
Citosqueleto
O citosqueleto permite a organizao espacial das clulas, bem como a sua interaco mecnica com o
ambiente. Este um sistema de filamentos, de tal forma dinmico, que permite tambm que a clula
tenha uma certa mobilidade.
Dessa forma, so funes do citosqueleto:
Organizao espacial da clula
Movimentar os cromossomas na mitose
Conduo de organelos e do trfego intracelular
Suporte da membrana citoplasmtica
Permite mobilidade, nomeadamente que clulas como os espermatozides nadem, ou clulas
como os leuccitos se desloquem sobre superfcies.
Permite a contraco nas clulas musculares
Estas variadas funes dependem da presena de trs famlias de molculas proteicas que constituem
os filamentos que formam o citosqueleto, nomeadamente a actina, os filamentos intermedirios e os
microtbulos. Apesar do nome citosqueleto, sugerir algo rgido, a verdade que o citosqueleto no
esttico e est em permanentes modificaes.
Actina
A actina uma das protenas constituintes do citosqueleto. Representa cerca de 10%
das protenas totais das clulas musculares (percentagem em termos de massa) e
entre 1% e 5% das clulas no-musculares.
As subunidades individuais de microfilamentos de actina so denominadas de G-
actina (actina globular), que se organizam em polmeros filamentosos, denominados
de F-actina (actina filamentosa). As molculas de G-actina apresentam uma fenda de
ligao ao ATP e um io Mg
2+
. A F-actina apresenta uma estrutura em dupla hlice,
sendo que cada monmero de G-actina contacta com outros quatro. Estes
microfilamentos medem aproximadamente 7nm de dimetro e apresentam uma
sequncia igual de 36 em 36 nm.
Os microfilamentos apresentam polaridade, manifestando-se essa polaridade em
termos estruturais, funcionais e de alongamento. O plo positivo encontra-se na
extremidade barbed (em ponta de seta) e o plo negativo corresponde
extremidade pointed (estes nomes de extremidades aplicam-se sobretudo a quando
a actina se encontra associada miosina). Na extremidade pointed, a fenda de
ligao ao ATP da molcula de actina est em contacto com o citosol, enquanto na extremidade barbed,
a fenda ligao ao ATP da molcula de actina est ligada a outro monmero.
A formao de filamentos a partir de unidades de G-actina faz-se por trs fazes distintas nucleao,
alongamento e estado estacionrio. A fase de nucleao prende-se com a formao de um ncleo, um
oligmero formado por uma quantidade reduzida de monmeros de G-actina. Esta a etapa mais lenta
do processo de formao de filamentos e tambm a etapa limitante, devido instabilidade desses
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mesmos oligmeros formados. A lentido do processo de nucleao vantajosa para a clula, na
medida em que lhe permite determinar em que local sero formados os novos filamentos. A
polimerizao de filamentos feita apenas se existir uma determinada concentrao mnima de actina
na clula. Esta concentrao designada por critical concentration (C
C
) e difere nas duas extremidades.
Uma vez ultrapassada esta fase de nucleao, segue-se a fase de alongamento, na qual os monmeros
so rapidamente associados s extremidades. No final, encontramos um estado estacionrio, em que a
quantidade de monmeros adicionados equivale de monmeros que se dissociam do filamento.

A polaridade influencia tambm a polimerizao de filamentos. A adio de G-actina aos filamentos
ocorre preferencialmente no plo positivo e a sua remoo ocorre preferencialmente no plo negativo.
Este processo denomina-se por treadmilling e a sua ocorrncia est dependente da concentrao
citoslica de subunidades de G-actina. Dessa forma:
Para valores de concentraes de ATP-G-actina entre os valores de C
c
+
(concentrao crtica na
extremidade positiva) e C
c
-
(concentrao crtica na extremidade negativa), ocorre adio de G-
actina no plo positivo e remoo no plo negativo.
Para valores de concentraes de ATP-G-actina superiores aos valores de C
c
+
e C
c
-
, ocorre
adio de G-actina em ambos os plos
Para valores de concentraes de ATP-G-actina inferiores aos valores de C
c
+
e C
c
-
, ocorre
remoo de G-actina em ambos os plos.





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74

Protenas de ligao actina (actin-binding proteins)
Os microfilamentos podem sofrer capping, atravs do acrescento de CapZ no plo positivo ou de
tropomodulina no plo negativo. O capping dos microfilamentos no plo positivo impede o seu
crescimento nesse plo e o capping no plo negativo estabiliza o filamento.
Para que ocorra nucleao dos microfilamentos, deve haver ligao da G-actina formina. A ligao
desta protena extremidade positiva impede a ligao da CapZ, permitindo o crescimento do
filamento. A actividade das forminas regulada pela via de sinalizao da Rho-cinase.
As actin related proteins (ARP 2/3) permitem a nucleao e o crescimento no plo positivo. Contudo,
como a sua capacidade de nucleao baixa, este complexo precisa de filamentos formados e da
protena WASp. Esta ltima altera a conformao do complexo proteico em causa, permitindo a ligao
de um filamento de actina (mais prximo do plo positivo) ao filamento principal, existindo entre eles
um ngulo de 70. Isto leva a uma estrutura ramificada da actina.

Cerca de metade da actina total na clula ATP-G-
actina e a ADP-actina e a ATP-actina so convertveis. A
profilina liga-se ADP-G-actina, catalisando a
converso desta em ATP-G-actina (por troca de ADP por
ATP), ligando-se depois esta ltima ao plo positivo do
filamento de actina.
J a cofilina liga-se F-actina na regio da extremidade
negativa. Essa ligao destabiliza o filamento,
precipitando a quebra deste nesta extremidade. Isto
gera subunidades ADP-actina ligadas a cofilina e mais
extremidades negativas livres.
A timosina-
4
, por sua vez, liga-se ATP-G-actina,
inibindo a adio desta a qualquer uma das
extremidades. Esta protena est presente em grande
quantidade nas plaquetas, que apresentam grandes quantidades de actina.
De referir que este dinamismo na polimerizao da actina que torna possvel movimentos
intracelulares e emisso de prolongamentos citoplasmticos.
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Organizao dos filamentos de actina
Os filamentos de actina podem apresentar uma organizao em rede ou em feixe, podendo este ltimo
tipo de organizao ser em feixe contrctil, caso os filamentos se disponham em direces opostas, ou
em feixe paralelo, caso os filamentos se disponham paralelamente.
Os feixes contrcteis esto relacionados com a ligao da actina -actinina, permitindo que a miosina
II se interponha no feixe. Este tipo de feixes est muito presente nas clulas musculares. J os feixes
paralelos esto associados ligao da fimbrina e a
sua disposio, com poucos espaos entre os
filamentos, impede que a miosina II se interponha no
feixe. Este tipo de feixes existe nos filopodia,
projeces citoplasmticas presentes em clulas
migrantes e em microvilosidades. J associada a uma
organizao em rede, encontramos a protena
filamina.
No que concerne a protenas de ligao (cross-
linking), destaque ainda para a espectrina, que
permite fazer arranjos hexagonais, essenciais para a
manuteno da membrana citoplasmtica (algo que
mediado pelas anquirinas) e cujas mutaes resultam
em anemia esferoctica - fragilidade da membrana do
eritrcito. Por ltimo, a distrofina permite ligar o
citosqueleto de uma fibra muscular at membrana
citoplasmtica. A sua ausncia caracteriza-se por
distrofias musculares.
Sistema actina-miosina
As miosinas so uma super-famlia proteica, cuja funo a de converso de ATP em energia mecnica.
Existem cerca de 20 classes diferentes de miosinas, sendo que estas protenas, com excepo da de
classe VI (que participa na endocitose) movimentam-se sempre do plo negativo para o plo positivo da
actina. Mutaes nas miosinas podem causar cegueira e surdez.

De entre as protenas motoras encontramos as miosinas de classes I, II e V. A miosina de classe I, ao
ligar-se actina relaciona-se com a endocitose e com a associao de actina membrana.
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A miosina de classe V est associada ao transporte de organelos. Esta
classe miosina desloca-se passo a passo sobre a molcula de actina, ou
seja, uma das cadeias pesadas da miosina fica fixa actina, enquanto a
outra avana 72 nm em direco ao plo positivo.
Interaces entre a actina e a miosina da classe II
Os msculos esquelticos so compostos por fibras musculares, clulas multinucleadas, que
apresentam vrias miofibrilas dispostas em feixe. Estas so constitudas por unidades bsicas, os
sarcmeros, complexos multiproteicos, situados entre dois discos Z e onde encontramos feixes de
miosina de classe II intercalados com filamentos de actina. O facto de um feixe de miosina deslocar-se
por dois filamentos de actina permite que, aquando da contraco muscular, ocorra uma aproximao
dos filamentos de actina.

A miosina de classe II apresenta uma cabea (head), um pescoo (neck - com duas cadeias leves, uma
essencial e uma regulatria) e cadeias pesadas. Os feixes de miosina presentes num sarcmero
apresentam um total de 325 nm de comprimento.
A miosina de classe II forma complexos bipolares, atravs
da interaco de domnios presentes na cauda e
dispostos antiparalelamente. O seu movimento feito
com gasto de ATP quando esta molcula se liga
cabea da miosina, esta separa-se da actina,
movimentando-se. Quando ocorre a desfosforilao do
ATP em ADP+Pi, ela liga-se de novo actina. Este
movimento necessita tambm da presena de clcio, que
se liga troponina. Esta ligao modula a actividade da
tropomiosina, impedindo-a de obstruir os locais de
ligao miosina, na actina. Isto permite ento que a miosina se ligue actina e que se d a contraco
muscular.
O cap Z e a tropomodulina so estabilizadores do sarcmero, na medida em que, ocorrendo um capping
nos filamentos de actina, em ambas as extremidades, no ocorre crescimento nem regresso do
tamanho dos filamentos em causa. A nebulina e a titina funcionam como estabilizadores adicionais do
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77

sarcmero a nebulina estende-se ao longo do
filamento de actina desde o disco Z at
tropomodulina, onde se liga. Esta molcula
determina o comprimento dos filamentos de actina
presentes no sarcmero. A titina outra grande
protena ligada por um lado ao disco Z e, por outro,
molcula contralateral. Esta uma molcula
elstica que previne um alongamento excessivo e
que segura os filamentos de miosina.
As fibras contrcteis actina/miosina II tambm
funcionam em clulas no-musculares,
nomeadamente ao nvel da citocinese, formando o anel contrctil regulado por fosforilao e que
permite a diviso das duas clulas e ao nvel da migrao celular.



















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Citosqueleto Microtbulos e filamentos intermedirios
Microtbulos
Os microtbulos so polmeros de dmeros de
-tubulina, que se dispe numa mesma linha,
numa estrutura de 8 nm. Este polmero dispe-se
sob a forma de tbulos ocos com um dimetro de
25 nm. Tal como os filamentos de actina, os
microtbulos apresentam polaridade, sendo que
na extremidade negativa esto expostas subunidades de -tubulina e na positiva, subunidades de -
tubulina.
A polimerizao dos microtbulos
ocorre de modo similar ao da dos
filamentos de actina, compreendendo
uma fase de nucleao, em que a
adio de dmeros de -tubulina
mais lenta, uma de alongamento e
uma ltima de estado estacionrio,
ocorrendo a adio de monmeros
preferencialmente na extremidade
positiva dos microtbulos. A
temperatura revela-se como um
factor que influencia a polimerizao
dos microtbulos, pois a
temperaturas inferiores a 4 C ocorre
despolimerizao destes.
Tal como acontece ao nvel da polimerizao de actina, tambm aqui se verifica a ocorrncia de
treadmilling, ou seja, a concentraes de tubulina intermdias entre C
c
+
e C
c
-
(as que existem no citosol)
ocorre preferencialmente adio de monmeros no plo positivo e remoo no plo negativo. De
referir que, na clula a polimerizao dos microtbulos favorecida despolimerizao.
Intrinsecamente associada polimerizao de microtbulos temos o conceito de instabilidade dinmica
ao nvel da extremidade positiva. Acontece que estes se vo formando, estando presente GTP nas
subunidades -tubulina. Quando o GTP convertido a GDP, a conformao das subunidades alterada,
levando a que o polmero passe
a apresentar ligaes mais
fracas. Ora, isto leva a que o
proteofilamento se curve e a
que ocorra o desmembramento
de dmeros de -tubulina do
microtbulo, que entra numa
situao de catstrofe.
Contudo, um microtbulo que
entrou em catstrofe pode
recuperar as suas dimenses,
entrando num processo de
resgate.
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A colquicina, vimblastina e colcemid impedem a polimerizao dos microtbulos. O taxol (que se extrai
da rvore Teixo do Pacfico) provoca a polimerizao rgida. Todas estas substncias tm aplicao
teraputica como quimiostticos.
MTOC
Os microtbulos so organizados nos
MTOCs - Microtubule organizing centers.
Esta estrutura, da qual os microtbulos
emergem com as extremidades positivas
voltadas perifericamente, apresenta duas
funes principais a organizao dos
flagelos e clios nos eucariontes e do fuso
acromtico que separa os cromossomas
durante os processos de diviso celular
(mitose e meiose). tambm nos MTOCs que ocorre a nucleao dos microtbulos. Entre os tipos de
MTOCs, destaque para o centrossoma e para os corpsculos basais (associados com os clios e certas
junes intercelulares de clulas epiteliais). Encontramos tambm MTOCs na regio do cone axonal do
neurnio.
A -tubulina forma complexos anelares (-TuRCs) que facilitam a nucleao dos microtbulos. Esta
protena por isso encontrada sobretudo nos centrossomas. Os centrossomas so organelos que
funcionam como reguladores da progresso do ciclo celular, permitindo o movimento cromossmico,
durante a diviso celular. Estes so compostos por dois centrolos dispostos perpendicularmente,
rodeados por uma massa amorfa de protena (o material pericentriolar). Visto num corte transversal um
centrolo apresenta nove tripletos de microtbulos.
Dentro dos clios e dos flagelos, o citosqueleto de microtbulos denominado de axonema. O axonema
dos clios apresenta tipicamente um anel externo com nove pares de microtbulos e, centralmente, um
par de microtbulos. A mobilidade do clio ocorre conta da dinena axonemal. Os corpsculos basais
encontram-se na base dos clios ou flagelos e so os locais que permitem o crescimento dos microtbulo
no axonema. Estas estruturas derivam dos centrolos apresentando uma estrutura similar de nove
tripletos de microtbulos.
Protenas associadas aos microtbulos
possvel a ligao de protenas aos microtbulos (Microtubule-associated proteins - MAPs). A protena
Tau uma MAP, na qual mutaes podem levar desintegrao de microtbulos neuronais nos doentes
de Alzheimer. J a protena TIP EB1 associa-se exclusivamente s extremidades positivas dos
microtbulos, estabilizando-os. A cinesina-13 uma protena que desagrega os microtbulos, a partir de
ambas as suas extremidades, atravs da sua ligao aos dmeros -tubulina, algo que ocorre com
consumo de ATP, enquanto a estatmina desagrega os microtbulos ligando-se a dois dmeros de -
tubulina.
As dinenas e as cinesinas so as duas grandes classes de protenas motoras dos microtbulos. Existem
14 classes de cinesinas e estas em termos gerais e estruturais apresentam uma cauda, onde est
presente a cadeia leve, um stalk ( espcie de um corpo em dupla hlice) e uma cabea, ligada ao stalk
por uma regio de linker. Esta classe proteica movimenta-se no sentido da extremidade positiva do
microtbulo. As cinesinas-1 e 2 permitem o transporte dos organelos, aos quais se ligam pela cauda (a
cabea liga-se ao microtbulo). A cinesina-5 bipolar e permite o deslizamento de dois microtbulos,
enquanto a cinesina-13 promove a destruio dos microtbulos. O movimento das cinesinas feito
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passo a passo e com consumo de ATP, que ao ligar-se cabea motora da frente promove o avano
da cabea motora de trs, que ao ligar-se aos microtbulos libertam ADP, permitindo uma posterior
ligao de ATP.

J as dinenas movimentam-se no sentido da extremidade negativa do microtbulo, tambm passo a
passo e com consumo de ATP. A sua estrutura apresenta um domnio de ligao ao microtbulo, um
stalk, uma cabea com um domnio ATPase e um tronco
com o domnio de ligao dinactina. A dinactina uma
protena que se liga dinena e cinesina II, permitindo a
ligao da dinena aos organelos e, consequentemente, o
seu transporte.
Compreendemos que so os microtbulos, bem como as
protenas motoras com eles relacionadas, os responsveis
pela organizao do citoplasma, pela manuteno do
correcto posicionamento dos seus organelos e pelo
transporte no s de organelos, como tambm de
vesculas.
Filamentos intermedirios
Os filamentos intermedirios so estruturas exclusivas das clulas animais que, apesar de
bioquimicamente heterogneos tm como caractersticas comuns o facto de no apresentarem
polaridade, de no polimerizarem nem despolimerizarem, de poderem estar presentes no ncleo
(contrariamente actina e aos microtbulos) e de apresentarem grande resistncia mecnica. Os
filamentos intermedirios so codificados por 70 genes humanos diferentes, existindo cinco classes
destes que se encontram sintetizadas na tabela da pgina seguinte:
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As unidades bsicas dos filamentos intermedirios so dmeros. Estes, em todas as classes, apresentam
um domnio em -hlice, constitudo por 310 aminocidos, um terminal amina (correspondente
cabea) e um terminal carboxilo (correspondente cauda). Os dmeros associam-se em direces
opostas, formando tetrmeros simtricos (razo pelas quais os filamentos intermedirios no tm
polaridade). Os tetrmeros associam-se formando protofilamentos e quatro protofilamentos formam
uma protofibrilha. Quatro
protofibrilhas, por sua vez,
associam-se formando um
filamento de 10 nm. Dessa
forma, um filamento
intermdio apresenta 16
protofilamentos.
As percursoras da formao de todos os filamentos intermedirios so as laminas nucleares, em cujas
mutaes, verificamos a presena de progerias como a de de Hutchison-Gilford ou distrofias musculares
como a de Emery-Dreifuss.
Os neurofilamentos esto presentes nas clulas neuronais, sendo constitudos por trs protenas a NF-
L, a NF-M e a NF-H. J a queartina est presente na constituio do cabelo, pele e unhas e da que a
epidermlise bulhosa seja causada por mutaes na queratina K14. Esta patologia manifesta-se atravs
da formao de filamentos intermedirios muito frgeis.
No citosqueleto h uma constante interaco entre os vrios tipos de filamentos. A ttulo de exemplo,
os fibroblastos encontramos filamentos de plectinas, ligando os microtbulos a filamentos
intermedirios. Tambm, os melanossomas so transportados ao longo de microtbulos e no cortex
celular, ligam-se a miosina V, deslocando-se sobre os microfilamentos de actina.


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Atlas de Microscopia de Biologia Celular e Molecular
Tipos de clulas
A. Clulas procariticas
ML - Bactrias Gram-positivas (Staphylococcus)

Observam-se numerosas clulas coradas de roxo, esfricas (cocos), isoladas ou em cacho.
ML - Bactrias Gram-negativas (Escherichia coli)

As clulas esto agora coradas de vermelho e so alongadas, em bastonete (bacilos).
Colorao de Gram: roxo de metilo a 0,5% + lugol, diferenciao pelo lcool-acetona e passagem pela
fucsina cida. As bactrias Gram positivas mantero a cor do roxo de metilo; as Gram negativas perd-
la-o na diferenciao pelo lcool-acetona ficando apenas coradas pela fucsina (vermelho).



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83

ME- Bactria Gram positiva - Bacillus subtilis

Vem-se 4 bacilos resultantes de duas divises sucessivas. Entre as duas clulas centrais, a parede
celular completa, o que no sucede entre as clulas, ainda no totalmente individualizadas, das
extremidades. Observa-se o nucleide que possui DNA filamentoso disperso e os ribossomas. A parede
celular densa, homognea e no estratificada. Contm peptdeoglicanos (murena), substncia em
grande parte responsvel pela Gram-positividade da bactria.





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ME - Gram-negativo. E. coli

Alm das estruturas descritas na imagem anterior, notar a membrana citoplasmtica e a parede celular
formada por: camada densa, delgada, contendo murena e uma segunda membrana (membrana externa
da parede) anloga citoplasmtica.






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ME - Bactria fotossinttica. Rhodospirillium rubrum, Gram-negativo

No citoplasma em redor do nucleide claro, numerosas vesculas, os cromatforos, em cuja membrana
limitante existe o sistema fotossinttico. Trata-se de uma clula autotrfica, capaz de sintetizar
compostos orgnicos quartenrios a partir do C, H, O e N da atmosfera e da gua.




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ME - Cianfita

Apresenta estrutura semelhante s bactrias Gram- mas, alm disso, no citoplasma vem-se sistemas de
membranas sobrepostas, funcionalmente semelhantes ao grana das plantas superiores, derivados de
invaginaes da membrana citoplasmtica. Estes organismos so includos nos procariontes por no
terem ncleo individualizado ou mitocndrias, mas executam a fotossntese como as plantas superiores,
produzindo inclusive hexoses.








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B. Clulas eucariticas
ML - Levedura (Saccharomyces cerevisiae) Wright

Nesta preparao observam-se vrias clulas, com contornos bem definidos, devido presena de
parede celular. No seu interior existem vacolos em nmero distinto, e por vezes, possvel distinguir o
ncleo.
ML - Observao de folhas vivas de Elodea em montagem aquosa










Notam-se fiadas de clulas rectangulares limitadas por parede celular acastanhada. No interior da clula
observa-se o ncleo ovide, pouco distinto, e os plastos perifricos, ovalares e verdes, que se deslocam
lentamente quando iluminados.
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ME - Corte de folha jovem de alface

Caractersticos de uma clula vegetal so: a parede celular distinta da membrana citoplasmtica, os
vacolos (pequenos numa clula jovem) os plastos (antes de termos cloroplastos totalmente formados,
designamos estas estruturas por plastos) cujos tilacides os permitem distinguir das mitocndrias e a
riqueza em ribosomas livres. Notar ncleo, com regies de heterocromatina e eucromatina, nuclolo e
invlucro nuclear, que apresenta duas membranas, uma externa e uma interna.




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ME - Corte de folha desenvolvida de beterraba

Nesta folha, quase todos os vacolos confluram num nico enorme. Em quase todos os plastos h
massas densas de amido.




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ME- Clula de fgado de rato

Nesta clula heptica observam-se o retculo endoplsmico rugoso (RER), ao qual esto associados
ribossomas, mitocndrias, lisossomas (que apresentam forma aproximadamente circular, sendo muito
electronodensos e tendo granulaes vrias, sendo, por isso, muito heterogneos entre si) e
perixossomas, cuja funo passa pela eliminao de radicais livres, resultantes de reaces celulares e
pela oxidao de lipdeos. Os peroxissomas apresentam um aspecto liso, sendo menores que os
lisossomas e tendo uma membrana mais recortada. So ainda visveis depsitos de glicognio, visto esta
ser uma clula heptica. Estes depsitos apresentam-se como massas escuras, podendo ser constitudas
por pintas agregadas (partculas alfa), ou dispersas (partculas beta). A membrana citoplasmtica no
visvel no campo, mas entre o ncleo e o citoplasma v-se o invlucro nuclear com as suas duas
membranas e complexos de poro nuclear (interrupes do invlucro).

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Ncleo
A Morfologia do ncleo em interfase em microscopia de luz
ML - Fgado do rato. H + E
No interior dos ncleos observa-se uma
trama irregular de filamentos e grnulos
arroxeados (basfilos). Destacam-se um
ou dois grnulos maiores, que so os
nuclolos. Os restantes elementos
corados representam a cromatina
condensada ou heterocromatina estando
a eucromatina dispersa no ncleo. Pela
colorao no possvel distinguir o
nuclolo (RNA) da cromatina (DNA) dado
que ambos so basfilos.


Corpo cavernoso humano Microscopia de fluorescncia

Marcao de ncleos celulares com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que se liga fortemente ao DNA e
emite uma radiao azul visvel em microscopia de fluorescncia. largamente utilizado para corar
ncleos celulares e cromossomas em microscopia de fluorescncia.

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B - ME - Cromatina expandida de um ncleo em interfase

Cromatina organizada sob a forma de nucleosomas na fibra de 10 nm, a expandir-se de um ncleo em
interfase aps extraco do invlucro com detergente e tratamento com tampo hipotnico.




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C- Invlucro nuclear
Pncreas de rato Deteco das laminas A+C por imunocitoqumica + hematoxilina
Cortes de pncreas de rato foram
incubados com anticorpo primrio
produzido na cabra anti-laminas A+C, a
que se seguiu um secundrio de ratinho
anti - cabra e um complexo de
estreptavidina-peroxdase que foi
evidenciado com DAB. Em muitos
ncleos observa-se uma circunferncia
castanha a delimitar os ncleos,
correspondente lmina nuclear
fibrosa que integra o invlucro nuclear.


ME - Ncleo de clula do crtex supra-renal do rato
Observa-se o invlucro nuclear constitudo por duas membranas perinucleares separadas por uma
cisterna. Estas so contnuas nos complexos de poro nuclear (cabea de seta). No interior do ncleo (N)
observa-se um nuclolo (nu) e cromatina condensada - heterocromatina (hc) junto ao nuclolo e na
periferia, e cromatina dispersa - eucromatina (ec) em toda a rea do nucleoplasma com organizao
granular no compacta. No nuclolo distingue-se, o componente granular (3), os centros fibrilares (1)
rodeados por componente fibrilar denso (2). Observar os grnulos pericromatnicos (setas) com
dimetro aproximado de 40 nm, e halo envolvente com 25 nm de espessura (setas).Este material foi
tratado para autorradiografia, observando-se alguns gros de prata (crculos).
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ME - Matriz nuclear do hepatcito do rato

As matrizes nucleares foram obtidas a partir de ncleos isolados, extradas com nucleases, detergentes
e tampes salinos. No invlucro nuclear residual, observam-se os complexos de poro nuclear (seta),
lmina nuclear (L) e restos de membranas do invlucro (i). Observa-se grnulos intercromatnicos
(cabea de seta). Os nuclolos apresentam-se muito compactados devido aco qumica do processo
de extraco. A cromatina foi totalmente removida pela DNaseI que se utilizou.




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D - Nuclolo
Ver lmina Ncleo de clula do crtex supra-renal do rato

Aps a administrao de 4-APP (4-aminopirazolopirimidina), o nuclolo fragmenta-se evidenciando
melhor algumas das suas estruturas: centro fibrilar (1), componente fibrilar (2), e componente granular
(3). No se observa a cromatina condensada associada ao nuclolo. Este aspecto devido aco da
droga.
E - Ncleos em replicao de DNA
Supra-renal de rato. Deteco por imunocitoqumica do PCNA (Proliferating Cell
Nuclear Antigen). + hematoxilina

Cortes de glndula supra-renal de rato
foram incubados com anticorpo
primrio, anti-PCNA, depois com um
secundrio de cabra anti-ratinho e um
complexo de estreptavidina-peroxdase
que foi evidenciado com DAB.
Observam-se numerosos ncleos com
tonalidade castanha escura,
demonstrando a replicao do DNA, em
contraste com a colorao azul dos
restantes.
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Focos de replicao do ncleo

Observao por microscopia de fluorescncia dos focos de replicao no ncleo celular em interfase de
clulas humanas em cultura, onde evidente co-localizao (amarelo-figura da direita) do PCNA (Red
fluorescent protein RFP-vermelho) e da DNApolimerase (green flourescent protein GFP - verde). De
modo a exprimir as duas protenas fluorescentes, transfectaram-se as clulas com plasmdeos contendo
o cDNA do PCNA, e DNApolimerase em fuso com cDNA codificantes para as RFP e GFP,
respectivamente.
F - Transcrio e splicing do mRNA
Domnios de transcrio e speckles
Observao por imunofluorescncia da localizao da histona H3 hiperacetilada (vermelho) no ncleo
em interfase de fibroblastos humanos. O DNA est corado de azul pelo DAPI (figura A). Evidncia de que
a hiperacetilao da histona H3 (vermelho) co-localiza com os focos de transcrio (figura B), onde
ocorre incorporao de bromo-uridina BrU (verde) na sntese de RNA. Na figura C observa-se os speckles
que correspondem aos grnulos intercromatnicos evidentes em TEM, e que acumulam pequenas RNP
que efectuam o splicing dos mRNAs. A sua distribuio assemelha-se dos focos de transcrio dos
mRNAs.

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ME - Ncleos isolados a partir de clulas do crtex suprarrenal
A fraco de ncleos foi obtida por ultracentrifugao (90.000g). Observam-se os vrios componentes
de ncleo - heterocromatina (hc), eucromatina (ec), nuclolo compactado (nu) e grnulos
intercromatnicos (speckles) em grupos, com dimetro de 20 - 25 nm (cabea de seta).
Corpos de Cajal

Identificao da protena coilina por imunofluorescncia, e de pequenos RNAs por hibridao in situ nos
corpos de Cajal em clulas HeLa (branco-resultante da sobreposio de vrios fluorocromos), O DNA
est corado com DAPI azul. No painel da direita observa-se uma grande ampliao de um corpo de Cajal
aps imunocitoqumica ultra-estrutural da protena coilina, detectada com um anticorpo primrio anti-
coilina, e um secundrio conjugado com partculas de ouro coloidal de 5 nm (setas).