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A principal funo de qualquer microscpio tornar visvel ao olho humano o que for
muito pequeno para tal. A forma mais antiga e usual a lupa seguida do microscpio ptico, que
ilumina o objeto com luz visvel ou luz ultravioleta. O limite mximo de resoluo dos
microscpios pticos estabelecido pelos efeitos de difrao devido ao comprimento de onda
da radiao incidente. Os microscpios pticos convencionais ficam, ento, limitados a um
aumento mximo de 2000 vezes,
porque acima deste valor, detalhes menores so
imperceptveis. Para aumentar a resoluo pode-se utilizar uma radiao com comprimento de
onda menor que a luz visvel como fonte de iluminao do objeto. Alm disso, a profundidade
de campo inversamente proporcional aos aumentos, sendo necessrio, ento, um polimento
perfeito da superfcie a ser observada, o que s vezes incompatvel com a observao desejada
(KESRENBACHK, 1994).
Um microscpio eletrnico de varredura (MEV) utiliza um feixe de eltrons no lugar de
ftons utilizados em um microscpio ptico convencional, o que permite solucionar o problema
de resoluo relacionado com a fonte de luz branca.
resoluo que pode ser obtida quando as amostras so observadas; valores da ordem de 2 a 5
nanmetros so geralmente apresentados por instrumentos comerciais, enquanto instrumentos
de pesquisa avanada so capazes de alcanar uma resoluo melhor que 1 nm (NAGATANI et
al. 1987).
Outra caracterstica importante do MEV a aparncia tridimensional da imagem das
amostras, resultado direto da grande profundidade de campo. Permite, tambm, o exame em
pequenos aumentos e com grande profundidade de foco, o que extremamente til, pois a
imagem eletrnica complementa a informao dada pela imagem ptica.
HISTRICO
O MEV um dos mais versteis instrumentos disponveis para a observao e anlise
das caractersticas microestruturais de materiais slidos. O primeiro trabalho reconhecido
descrevendo o conceito de um MEV o de Knoll (KNOLL,1935). Mais adiante, Von Ardenne
em 1938 construiu um microscpio eletrnico de varredura e transmisso (STEM) adaptando
bobinas de varredura a um microscpio eletrnico de transmisso (VON ARDENNE, 1938).
O primeiro MEV usado para observar amostras espessas foi descrito por Zworykin e
colaboradores em 1942 (ZWORYKIN et al., 1942). Os autores descreveram que a emisso de
eltrons secundrios poderia ser responsvel pelo contraste topogrfico da imagem gerada. O
coletor foi polarizado positivamente em relao amostra com 50Volts e os eltrons
secundrios coletados produziram uma queda de voltagem no resistor. Esta queda de voltagem
foi enviada a uma tela de televiso para produzir a imagem; entretanto, a resoluo atingida foi
de apenas 1m. Esta resoluo foi considerada insatisfatria pela equipe, visto que buscavam
atingir uma resoluo maior de 0,5 m atingida pelos microscpios pticos. Ao reduzir o
dimetro do feixe eletrnico spot, bem como aperfeioar a razo sinal/rudo, foi construdo um
novo instrumento. Uma anlise detalhada da relao entre aberraes das lentes, brilho do
canho e tamanho do dimetro do feixe resultou em um mtodo para determinar o tamanho
mnimo do dimetro do feixe em funo de sua corrente (ZWORYKIN et al., 1942). A
contribuio posterior do grupo foi usar um tubo multiplicador dos eltrons, como um pramplificador para a corrente de emisso secundria (eltrons secundrios) vinda da amostra,
mesmo assim as imagens ainda apresentavam rudo. O sistema 11 ptico-eletrnico do
instrumento consistia de trs lentes eletrostticas com bobinas de varredura posicionadas entre a
segunda e terceira lentes apresentando uma resoluo aproximada de 50 nm (500). A etapa
seguinte foi o aperfeioamento do detector de eltrons secundrios pelo mesmo autor
(ZWORYKIN et al., 1942). Porm, a etapa foi seguida por Everhart e Thornley (EVERHART;
THORNLEY,1960) que empregaram um cintilador para converter os eltrons em luz, os quais
eram, ento, transmitidos a um fotomultiplicador.
Desde o primeiro instrumento comercial de 1965 (Cambridge instrumentos cientficos
modelo Stereoscan), muitos avanos foram obtidos. Atualmente, os modernos microscpios
eletrnicos de varredura so equipados com estrutura digital que permite o armazenamento
temporrio da imagem para observao ou at mesmo a transferncia por rede para outras partes
do planeta. Alm disto, alguns modelos podem operar com baixo vcuo (linhas de ecologia) e
outros fazem parte da linha para produo em srie, e so utilizados na inspeo e controle de
qualidade de frmacos, semicondutores e peas de preciso.
PRINCPIO DE FUNCIONAMENTO
O princpio de um microscpio eletrnico de varredura (MEV) consiste em utilizar um
feixe de eltrons de pequeno dimetro para explorar a superfcie da amostra, ponto a ponto, por
linhas sucessivas e transmitir o sinal do detector a uma tela catdica cuja varredura est
perfeitamente sincronizada com aquela do feixe incidente. Por um sistema de bobinas de
deflexo, o feixe pode ser guiado de modo a varrer a superfcie da amostra segundo uma malha
retangular. O sinal de imagem resulta da interao do feixe incidente com a superfcie da
amostra. O sinal recolhido pelo detector utilizado para modular o brilho do monitor,
permitindo a observao. A maioria dos instrumentos usa como fonte de eltrons um filamento
de tungstnio (W) aquecido, operando numa faixa de tenses de acelerao de 1 a 50 kV. O
feixe acelerado pela alta tenso criada entre o filamento e o nodo. Ele , em seguida,
focalizado sobre a amostra por uma srie de trs lentes eletromagnticas com um spot menor
que 4 nm. O feixe interagindo com a amostra produz eltrons e ftons que podem ser coletadas
por detectores adequados e convertidas em um sinal de vdeo.
Quando o feixe primrio incide na amostra, parte dos eltrons difunde-se e constitui um
volume de interao cuja forma depende principalmente da tenso de acelerao e do nmero
atmico da amostra, conforme figura 1.2. Neste volume, os eltrons e as ondas eletromagnticos
produzidos so utilizados para formar as imagens ou para efetuar anlises fsico-qumicas.
Para serem detectados, as partculas e/ou os raios eletromagnticos resultantes da
interao do feixe eletrnico com a amostra devem retornar superfcie da amostra e da
atingirem o detector. A profundidade mxima de deteco, portanto, a resoluo espacial,
depende da energia com que estas partculas ou raios atingem o detector, ou so capturadas pelo
mesmo. Por exemplo: eltrons retroespalhados possuem maior energia do que os eltrons
secundrios, assim, o detector de eltrons retroespalhados ir operar na faixa de energia maior e
o de eltrons secundrios na faixa menor.
A imagem formada a partir do sinal captado na varredura eletrnica de uma superfcie
pode apresentar diferentes caractersticas, uma vez que a imagem resulta da amplificao de um
sinal obtido de uma interao entre o feixe eletrnico e o material da amostra. Diferentes sinais
podem ser emitidos pela amostra. Dentre os sinais 12 emitidos, os mais utilizados para obteno
da imagem so originrios dos eltrons secundrios e/ou dos eltrons retroespalhados.
Volume de interao: a) localizao dos sinais emitidos pela amostra; b) relao da voltagem
para elementos leves e pesados. Figura adaptada de KESTENBACH, 1994.
A imagem formada a partir do sinal captado na varredura eletrnica de uma superfcie
pode apresentar diferentes caractersticas, uma vez que a imagem resulta da amplificao de um
sinal obtido de uma interao entre o feixe eletrnico e o material da amostra. Diferentes sinais
podem ser emitidos pela amostra. Dentre os sinais emitidos, os mais utilizados para obteno da
imagem so originrios dos eltrons secundrios e/ou dos eltrons retroespalhados.
COMPONENTES DO MEV
O MEV convencional apresenta uma coluna ptico-eletrnica adaptada a uma cmara
com porta-amostra aterrado, sistema eletrnico, detectores e sistema de vcuo.
Cmara da Amostra
O compartimento onde so inseridas as amostras chamado de cmara de amostras. A
presso na cmara de, aproximadamente, 10-6 Torr ou menor e na pr-cmara, para os
modelos que a apresentam, de 10-3 Torr. A parte externa da cmara pode apresentar botes
para ajustes manuais que permitem variar deslocamento da amostra segundo trs direes (x, y,
z), a rotao da amostra, sendo que estes tambm podem ser acessados via software.
Fonte de gerao do feixe
A fonte de eltrons chamada de canho eletrnico e composta basicamente por trs
elementos: filamento de tungstnio (W) ou de hexaboreto de lantnio (LaB6) + ctodo (cilindro
de Whenelt) + nodo. O filamento aquecido (W geralmente a 2500C), o que causa uma
emisso terminica de eltrons. Os eltrons que so atrados para o nodo e mantidos em
potencial positivo em relao ao filamento na faixa de 1 a 30 kV. Na figura a seguir mostrada
uma representao do canho, observando-se que os trs constituintes so mantidos a diferentes
potenciais eltricos.
O filamento, percorrido por uma corrente eltrica, emite espontaneamente os eltrons
que so acelerados por um campo eltrico que lhes confere energia suficiente para atingir a
amostra que est localizada na cmara. Durante o percurso do feixe de eltrons at amostra,
existem vrios dispositivos eletromagnticas cuja a funo direcionar o feixe para o ponto de
anlise, que sero apresentados a seguir.
(A) Coluna ptico-eletrnica, (B) cmara da amostra com mesa para fixao dos suportes
metlicos, (C) detalhe dos detectores de eltrons secundrios, detectores de eltrons
retroespalhados e sonda de EDS.
MICROANLISE DE RAIOS-X
A microanlise eletrnica consiste na medida de raios-X caractersticos emitidos de uma
regio microscpica da amostra bombardeada por um feixe de eltrons. As linhas de raios-X
caractersticos so especficas do nmero atmico da amostra e, o seu comprimento de onda ou
sua energia podem ser utilizados para identificar o elemento que est emitindo a radiao.
Espectros de raios-X podem ser obtidos para todos os elementos da tabela peridica, com
exceo do hidrognio. Entretanto, a emisso dos primeiros dez elementos de baixo nmero
atmico consiste de bandas na regio de baixa energia onde as perdas por absoro na amostra
so grandes. Assim, elementos como carbono, oxignio e nitrognio so freqentemente
determinados por estequiometria.
Os raios-X emitidos da amostra devido ao bombardeio de eltrons do feixe podem ser
detectados pelo espectrmetro convencional de cristais ou pelos dispositivos de estado slido,
Silcio dopado com Ltio. O detector de raios-X e o MEV so concepes alternativas de
projeto do mesmo instrumento bsico, isto , partem do mesmo princpio fsico para resultados
diferenciados. O feixe de eltrons 20 suficientemente energtico para ionizar camadas
profundas dos tomos e produzir tambm a emisso de raios-X, alm da emisso de outras
partculas como os eltrons retroespalhados utilizados na formao da imagem. A resoluo
espacial da anlise depende da energia do raio-X detectado e da natureza do material. A figura
anterior mostra, de forma esquematizada, o processo de excitao de eltrons para produo de
raios-X.
No caso do WDS, a separao dos raios-X obtida por difrao dos ftons incidentes
caractersticos dos elementos presentes na regio atingida pelo feixe de eltrons do canho do
MEV. A lei de Bragg fornece a relao entre o comprimento de onda de raios-X, , e o ngulo
crtico de incidncia do feixe, para a interferncia construtiva, isto , n = 2dsen , onde n
um nmero inteiro e d o espaamento interplanar da famlia de planos difratados.
Na configurao de um microscpio eletrnico podem-se acoplar os dois detectores de
raios-X (EDS E WDS), que permitem coletar ftons produzidos pelo feixe de eltrons
primrios.
A zona analisada ser, portanto, aquela que percorrida pelo feixe. Se estivermos
trabalhando no modo de varredura (formao de uma imagem), ento a anlise ser de toda a
superfcie da imagem. possvel, tambm, parar a varredura e analisar em um ponto (spot), rea
ou linha selecionada na imagem.
O detector capaz de determinar a energia dos ftons que ele recebe. Fica possvel,
portanto, traar um histograma com a abscissa sendo a energia dos ftons (keV) e a ordenada o
nmero de ftons recebidos (contagens). O tempo necessrio para adquirir o espectro de boa
qualidade fica em torno de 2 minutos.
Espectro obtido por microanlise de raios-X caractersticos por EDS com tabela de
discriminao dos elementos analisados.
A interpretao dos espectros facilitada por uma base de dados que contm, para cada
elemento, as energias e a intensidade das raias que as produziu. possvel localizar, para cada
energia do espectro, a lista dos elementos que possuem uma raia neste domnio energtico. E,
tambm para cada elemento, fazer aparecer sobre o espectro um diagrama em barras
representando a posio e as energias das raias deste elemento. Cabe salientar que os elementos
em quantidade inferior a 0,2% em massa no podero ser detectados. Os elementos hidrognio
(H), ltio (Li), berlio (Be) no podero ser detectados pelas tcnicas citadas. importante
escolher uma tenso de acelerao compatvel com os elementos que se quer analisar. possvel
conhecer, por meio de clculos complexos, as quantidades respectivas dos diferentes elementos
analisados.
Aspectos Quantitativos
A determinao das porcentagens dos elementos por microanlise de raios-X uma
operao possvel no microscpio eletrnico. Existem vrios mtodos para quantificao dos
elementos qumicos presentes na amostra, sendo o mtodo mais simples o sem padres. Neste
caso, a anlise denominada semiquantitativa. O princpio consiste em avaliar a superfcie dos
picos que proporcional quantidade de tomos que produziu a raia. A quantificao consiste,
portanto, em medir a superfcie dos picos que se tem previamente identificada a ser atribudo
um coeficiente e ento calcular as porcentagens. As dificuldades so inmeras: h,
infelizmente, alm da quantidade, muitos outros parmetros (fora aqueles ligados ao material)
que fazem variar a superfcie dos picos a considerar como: a) tenso de acelerao; b) natureza
dos outros elementos presentes com os quais se faz a quantificao: as raias de um elemento
podem ser mais ou menos absorvidos pelos outros elementos que esto presentes no volume
analisado; c) repartio dos elementos no volume analisado (os programas de clculo
quantitativo so elaborados para os elementos que seriam repartidos de modo homogneo, fazer
ateno, portanto anlise de material com mltiplas fases (camadas, lamelas, incluses)) e d)
geometria da superfcie analisada (os programas de clculo quantitativo so elaborados para
superfcies planas, polidas).
Na prtica para determinar a superfcie dos picos preciso fazer a deconvoluo do
espectro. Esta operao consiste em fazer seguir os contornos do espectro por uma curva
matemtica sobre a qual sero efetuados os clculos desejados. necessrio, ainda, efetuar uma
correo sobre as superfcies medidas de maneira a levar em conta as diferentes interaes
fsicas que intervm no material. Por exemplo, pode-se utilizar a correo ZAF, que permite
ter em conta a influncia do nmero atmico dos elementos sobre a eficcia da excitao e da
deteco (fator Z), da probabilidade que um raio-X seja absorvido antes mesmo de ser detectado
(fator A) e da contribuio dos raios-X emitidos por um outro elemento (fluorescncia
secundria, fator F).
A anlise quantitativa consiste em se obter a concentrao a partir de relaes de
intensidade de raios-X da amostra em estudo e de um padro apropriado. Quando a composio
do padro prxima da composio da amostra, os efeitos da matriz sobre a intensidade de
raios-X so insignificantes e a anlise se reduz comparao das intensidades observadas.
Entretanto, na maioria dos casos utilizam-se padres de elementos puros porque possvel
caracteriz-los com bastante preciso, mas nestes casos a preciso da anlise depende
essencialmente do modelo de correo (GOLDSTEIN et al.,1992).
Influncia da Tenso de Acelerao na Microanlise
A tenso de acelerao do feixe de eltrons incidente um dos parmetros importantes
para a microanlise. Os eltrons incidentes no podero ejetar eltrons de uma energia superior
sua, o espectro ir, portanto, parar sobre o eixo das abscissas em um valor de energia que
corresponde tenso de acelerao. Por exemplo, se utilizada uma tenso de acelerao de
15kV, o fton mais energtico detectado ter uma energia de 15 kV. A quantidade de ftons
produzida em uma gama de energia tambm funo da tenso de acelerao. O mximo de
ftons de uma dada energia ser produzido por uma tenso de acelerao 2,5 vezes superior
energia dos ftons. Por exemplo, uma tenso de acelerao de 15 kV ser eficaz para produzir
ftons de 6 keV.
importante escolher uma tenso de acelerao compatvel com os elementos que se
analisa. Tenses de at 10 kV para elementos leves devero ser utilizadas, dando-se prioridade
s tenses maiores que 10 kV para os elementos mais pesados. Portanto, indispensvel para a
quantificao levar em conta a tenso de acelerao com a qual se faz a medida, porque pode-se
encontrar um grande pico sem que este signifique, obrigatoriamente, uma quantidade
importante. Este cuidado feito automaticamente pelo programa analisador de espectro.
PREPARAO DE AMOSTRAS
Materiais biolgicos, em geral, aps passar pelo processo de fixao e desidratao,
sero transferidos para a cmara do equipamento de secagem ao ponto crtico do CO2 (CPD critical point drying). Com a cmara isolada, em um volume de etanol absoluto ou acetona,
injeta-se o CO2 lquido, fazendo-se vrias substituies at remoo total do etanol ou acetona,
esta troca ocorre entre 0 e 5C. A amostra permanece sempre imersa na fase lquida. Eleva-se a
temperatura dentro da cmara entre 40 e 45 C e, conseqentemente, a densidade da fase lquida
diminui. O aumento da presso (de aproximadamente 73 atm) causa o aumento da densidade na
fase gasosa, pois devido ao aumento gradual da temperatura, as molculas adquirem energia
cintica e se convertem em gs, o que aumenta a presso interna na cmara. Quando estamos
prximos da temperatura crtica significa que as densidades da fase gasosa e lquida esto
prximas. Logo, quando o ponto crtico excedido, a fase gasosa e lquida apresentam a
mesma densidade, garantindo que a temperatura est em torno de um valor crtico onde no h
limites entre as fases, ou seja, o menisco de transio de fases desaparece. Nesta situao, a
tenso superficial igual a zero e todo o lquido se converteu em gs, assim se evita o efeito da
tenso superficial sobre a amostra. A cmara , ento, despressurizada at presso atmosfrica, e
a amostra removida da cmara. A amostra pode ento ser montada em um suporte metlico e
metalizada para ser observada no microscpio eletrnico de varredura. A figura 1.12 mostra um
exemplar de uma cmara de CPD tpica disponvel comercialmente. O processo de secagem ao
ponto crtico no totalmente livre de problemas. Alguns tipos de tecidos podem sofrer
contrao significativa, variando de 10 a 15% para tecidos nervosos a 60% para tecidos
embrionrios (BOZZOLA et al.,1999).
Para amostras fixadas em lminas ou lamnulas de vidro ou em filtros, pode-se utilizar
peas especiais para depositar as amostras na cmara de CPD, fabricadas em ao inoxidvel,
que previnem a quebra dos suportes dentro da cmara evitando que a amostra seja danificada.
emisso de eltrons, pois emitem mais eltrons que o material da amostra, facilitando a
construo da imagem (GOLDSTEIN et al.,1992).
Geralmente o mais utilizado o recobrimento por deposio de ons metlicos de ouro
(Au), liga de ouro-paldio (Au-Pd) ou platina (Pt), entre outros. Neste processo, as amostras so
colocadas em uma cmara com presso em torno de 0,1 a 0,05 mbar e o alvo metlico
bombardeado com tomos de gs inerte como, por exemplo, argnio. Os tomos do alvo so
depositados sobre a amostra. As mquinas utilizadas para esta finalidade so denominadas
metalizadoras e oferecem como parmetros de ajuste: corrente aplicada (em mA), tempo de
deposio e altura da amostra em relao ao alvo, a fim de que seja calculada a espessura do
metal depositado. No recobrimento a partir da evaporao, normalmente utilizado o carbono.
O revestimento com carbono usado para recobrir regies da superfcie em que os tomos de
ouro no tm cobertura efetiva, uma vez que so tomos maiores; ou ainda, quando no
desejada a incorporao de tomos na superfcie como, por exemplo, para anlise por raios-X
para determinao de ouro ou elemento prximo a ele na tabela peridica. O carbono tambm
recomendado para superfcies com diferenas de altura, pois, pelo mtodo da evaporao, os
tomos espalham-se de forma mais uniforme. Fibras de carbono so aquecidas em torno de
2000C em vcuo e evaporadas sobre a amostra. Para este procedimento utiliza-se a cmara de
uma metalizadora a qual acoplado um sistema para aquecimento das fibras de carbono.
Apesar do carbono no ser um bom emissor de eltrons, este elemento pode fornecer
um caminho condutor sobre as amostras mesmo em camadas muito finas. O mtodo de
impregnao metlica com OsO4 tambm utilizado para evitar estes efeitos.
A figura seguinte mostra um equipamento que pode ser utilizado para recobrimento das
amostras por sputtering ou por evaporao. Os recobrimentos metlicos utilizados por estes
procedimentos visam apenas tornar as amostras condutoras de modo a gerar imagens com boa
resoluo no MEV, portanto, preciso um controle da espessura depositada a fim de evitar
artefatos na imagem que podem mascarar a superfcie real da amostra.