O estudo da célula:

Microscopia, técnicas
histológicas e histoquímicas
 Plano previsto da aula de hoje
I . Métodos de estudo III . Técnicas histológicas e
- Ultra-centrifugação histoquímicas
- Radioautografia - Coloração Histológica
- Microscopia . Preparo de tecidos
. Corantes acidófilos e
II . Microscopia basófilos
- Óptica
. de Luz ou de Campo Claro - Coloração Histoquímica
. de contraste de fase . PAS
. de Imunofluorescência . Alcian-Blue
. Confocal . Feulgen

- Eletrônica IV. Aula Prática

. Transmissão - Lâminas
. Varredura - Pranchas
 Plano da aula
I . Métodos de estudo
- Ultra-centrifugação
- Radioautografia
- Microscopia
II . Microscopia
- Óptica
. de Luz ou de Campo Claro
. de contraste de fase
. de Imunofluorescência
. Confocal
III . Técnicas histológicas e
histoquímicas
- Coloração Histológica
. Preparo de tecidos
. Corantes acidófilos e
basófilos
- Coloração Histoquímica
. PAS
. Alcian-Blue
. Feulgen

- Eletrônica IV. Aula Prática

. Transmissão - Lâminas
. Varredura - Pranchas
 Métodos de estudo de estrutura
e função celular em Biologia Celular
1) Ultracentrifugação: separa os componentes de acordo com as suas densidades

2) Radioautografia:
. Metabolismo do DNA: Timidina 3H
. Metabolismo do RNA: Uridina 3H
. Proteínas: Metionina 35S
. Carboidratos: manose 14C

3) Microscopia:
- Óptica:
. Coloração Histológica
. Coloração Histoquímica
. Imunohistoquímica

- Eletrônica:
. Transmissão
. Varredura
 Microscopia Óptica
- Poder (ou limite) de Resolução: menor distância entre duas partículas que permite que elas sejam
vistas como dois objetos individualizados. (Fator mais crítico p/ o microscópio fornecer uma
imagem detalhada).

- Limite de resolução do microscópio óptico: 0.2 μm (200 nm)

- Limite de resolução é diferente de capacidade de aumento.

partes mecânicas: partes ópticas

(sistemas de lentes):
. platina (base)
. charriot . condensador;
. tubo . objetiva;
. revólver . ocular
Métodos de estudo: unidades de medida
Boa imagem = poder de resolução = capacidade de separar detalhes.

Poder de resolução (limite de resolução): menor distância para que duas partículas apareçam
como objetos individualizados.

Limite de resolução do microscópio óptico: 0.2 μm (ou 200nm)

Limites de Resolução

Microscópio eletrônico Microscópio óptico Olho humano

10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 (mm)

0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 (μm)

1000 vezes
Poder de resolução da microscopia
 Microscopia óptica
(campo claro ou de luz)
- Fonte de luz + condensador: focaliza os raios de luz na
amostra. O sistema de lentes permite a visualização da
amostra.

- parte da luz é absorvida quando passa através da

amostra.

- Diferentes estruturas absorvem a luz de maneira

diferente.

- A coloração é importante para a distinção de

estruturas.
 Microscopia óptica
(campo claro ou de luz)
Etapas de preparo para estudo histológico:
1º.) Fixação: preservar a morfologia e a composição dos tecidos.

2º.) Desidratação e clareamento: remover a água dos tecidos; e, embeber a peça

em substância miscível com parafina (Ex.: clareamento c/ xilol).

3º.) Inclusão (ou embebição): a peça é colocada em um molde retangular

contendo a parafina fundida.

4º.) Microtomia: cortes delgados das peças em micrótomo (1-10 μm espessura)

para colocação sobre lâminas de vidro.

5º.) Coloração: utilização de corantes para evidenciar os componentes dos tecidos.

 Microscopia de Contraste de Fase
- Permite o exame de células e tecidos vivos (não corados).

- Pequenas diferenças de refração entre as diferentes partes das células e dos

tecidos expostos ao feixe de luz principal dão o contraste.

Microscopia de Fluorescência
- Algumas substâncias quando excitadas por certos comprimentos de onda
emitem luz de maior comprimento de onda (Fluorescência)

- Excitação em Luz U.V. : emissão na faixa de luz visível (utilização de filtros)

- Exemplos: Fluorescência naturais, Imunofluorescência (anti-FITC, PE),

proteínas fluorescentes (GFP, YFP).
 Microscopia Óptica:
de luz e contraste de fase

MO: Luz convencional MO: Contraste de fase

Microscopia de
Fluorescência

Alaranjado de Acridina
 Microscopia Óptica: confocal
- Focaliza um plano de foco muito
delgado da amostra a ser analisada.

1- Laser: fonte luminosa

2- Componente(s) da amostra em
análise deve(m) estar marcado(s)
com uma molécula fluorescente.

3- Luz refletida pela amostra (usada p/

formar a imagem) é capturada por um
detector para ampliação do sinal.
 Microscopia óptica
(campo claro ou de luz)
Etapas de preparo para estudo histológico:
1º.) Fixação: preservar a morfologia e a composição dos tecidos.

2º.) Desidratação e clareamento: remover a água dos tecidos; e, embeber a peça

em substância miscível com parafina (Ex.: clareamento c/ xilol).

3º.) Inclusão (ou embebição): a peça é colocada em um molde retangular

contendo a parafina fundida.

4º.) Microtomia: cortes delgados das peças em micrótomo (1-10 μm espessura)

para colocação sobre lâminas de vidro.

5º.) Coloração: utilização de corantes para evidenciar os componentes dos tecidos.

Micrótomo
Manivela
Suporte do bloco
Bloco de parafina

Fragmento de tecido
Navalha
Análise
em microscópio
 Plano da aula
I . Métodos de estudo
- Ultra-centrifugação
- Radioautografia
- Microscopia
II . Microscopia
- Óptica
. de Luz ou de Campo Claro
. de contraste de fase
. de Imunofluorescência
. Confocal
III . Técnicas histológicas e
histoquímicas
- Coloração Histológica
. Preparo de tecidos
. Corantes acidófilos e
basófilos
- Coloração Histoquímica
. PAS
. Alcian-Blue
. Feulgen

- Eletrônica IV. Aula Prática

. Transmissão - Lâminas
. Varredura - Pranchas
 Técnicas histológicas e histoquímicas
Técnica histológica versus Técnica Histoquímica
1) Técnica histológica
Evidenciar morfologia: uso de corantes basófilos ou acidófilos
. Estrutura de caráter básico 🡪 afinidade por corante ácido
. Estrutura de caráter ácido 🡪 afinidade por corante básico

EOSINA 🡪 corante ácido (cor rósea)

HEMATOXILINA 🡪 corante básico (cor azul/arroxeada)

Tipos principais de coloração histológica:

Corantes básicos:
Hematoxilina, Azul de Toluidina, Azul de Metileno
HE Corantes ácidos:
Eosina, Orange de Acridina, Fucsina Ácida
Hematoxilina Eosina Hematoxilina/Eosina
Hematoxilina Eosina Hematoxilina/Eosina
Hematoxilina Eosina Hematoxilina/Eosina
 Eosina

Hematoxilina
 Técnicas histológicas e histoquímicas

Ácino
Hematoxilina
HE
Eosina

Base de células ricas em RNA (Hematoxilina)

Grânulos de Secreção (Eosina)

Ácinos do pâncreas corados por HE

 Técnicas Histológicas e Histoquímicas
Técnica histológica versus Técnica Histoquímica
2) Técnica histoquímica
Caracterização química: localização

2.1 Características Gerais

a) Preservação e imobilização do composto (fixação e processamento adequado)

b) Especificidade (contra-prova):. grupo de substâncias

. Substância ou radical
Ex.: DNA (Feulgen)

c) Sensibilidade: detecção de pequenas quantidades do composto.

d) Reação química conhecida: produto visível ao MO (corado) ou ME (eletrodenso).

 Técnicas Histológicas e Histoquímicas
2.1 Exemplos de Técnicas Histoquímicas

a) P.A.S.
Periodic Acid-Schiff (Ácido Periódico-Schiff)
Demonstração de radicais 1,2-glicol presentes em amido, glicogênio e celulose

C C - Glicogênio
- Glicoproteínas neutras
- Glicoproteínas ácidas ricas em Ácido
OH OH siálico: Sialomucinas

A técnica P.A.S. não é específica para o glicogênio, mas para evidenciar

o glicogênio (...e outros polissacarídeos).
 Técnicas Histológicas e Histoquímicas

Etapas da Reação P.A.S.

1) Preparação do Reagente de Schiff:

Fuccsina básica (cor bonina) + ácido sulfuroso = Reativo de Schiff (incolor)

2) Oxidação, pelo ácido Periódico, dos radicais 1,2-glicol formando grupamentos de aldeídos:

C C
+ HIO
(ácido periódico) =
4 Aldeído
OH OH
 Técnicas Histológicas e Histoquímicas

Etapas da Reação P.A.S.

3) reversão da cor do Reagente de Schiff:

Aldeído (liberado) + reativo de Schiff = Magenta/púrpura/bonina: PAS +

4) Contra-prova: confirmação da presença de glicogênio em lâmina controle
-> tratamento (prévio) com amilase salivar

Não
C C
+ amilase
+ HIO4
(Ácido Periódico)
= há liberação
de Aldeído
OH OH

PAS -
Coloração Histoquímica:

PAS
Contra-coloração
(Histológica):

HE
 Técnicas Histológicas e Histoquímicas

Vilosidade intestinal corada pela técnica de Ácido-periódico Schiff;

Contra-coloração: Hematoxilina
 Técnicas Histológicas e Histoquímicas

b) Alcian-Blue:
demonstração de radicais ácidos em pH específicos.

--> AB tem alta afinidade por

grupos carboxila (COOH pH
2,5) e de sulfato (SO4 pH 2,5 e
5) presentes em
glicoproteínas e
glicosaminoglicanas.

Reação AB positiva = cor

azul claro.
 Técnicas Histológicas e Histoquímicas

c) Reação de Feulgen
demonstração de aldeídos liberados.

Especificidade = DNA
Etapas da Reação de Feulgen:
1) Hidrólise do DNA com HCl a 60oC para liberação de aldeídos.
2) tratamento dos aldeídos (liberados) com o reativo de Schiff.

Reação Feulgen Positiva = cor bonina

PLANOS DE CORTE: Problemas na interpretação de cortes

Análise
em microscópio
 Problemas na interpretação
de cortes

PLANOS DE CORTE
1

3
7e8

5e6
 Aula prática: Lâminas
Lâmina 69 – corte de Fígado
Coloração histológica: HE
 Aula prática: Lâminas
Lâmina 5 – corte de Intestino grosso
Técnica Histoquímica: Alcian-Blue
Contra-coloração histoquímica: hematoxilina
 Plano da aula
I . Métodos de estudo
- Ultra-centrifugação
- Radioautografia
- Microscopia
II . Microscopia
- Óptica
. de Luz ou de Campo Claro
. de contraste de fase
. de Imunofluorescência
. Confocal
III . Técnicas histológicas e
histoquímicas
- Coloração Histológica
. Preparo de tecidos
. Corantes acidófilos e
basófilos
- Coloração Histoquímica
. PAS
. Alcian-Blue
. Feulgen

- Eletrônica IV. Aula Prática

. Transmissão - Lâminas
. Varredura - Pranchas
 Microscopia Eletrônica
- Utiliza feixes de elétrons acelerados como fonte de luz
A ME se baseia na interação entre elétrons e componentes dos tecidos.

Limite de Resolução do MO: (550 nm) 0,55 μm a 0.2 μm

Limite de Resolução do ME: 0.005 nm a 0,001 μm

Microscopia eletrônica

Transmissão Varredura
 Microscopia Eletrônica
Etapas
A) FIXAÇÃO: fixadores que permitem maior preservação das estruturas. P. ex.:
glutaraldeído (proteínas) e Tetróxido de Ósmio (Componentes lipídicos). O T.
Ósmio, além de fixador, atua como contraste (alta massa molecular = desvia os elétrons
= elétron-denso.

B) DESIDRATAÇÃO: remover a água dos tecidos; e, embeber a peça em substância

miscível com a resina (époxi).

C) INCLUSÃO: material mais denso, resinas e plástico.

D) MICROTOMIA: cortes mais delgados (0,02 – 1 μm): navalhas de diamante ou

vidro. SUPORTE DOS CORTES: telas de níquel ou cobre.

E) “COLORAÇÃO”: utiliza metais pesados como contraste (acetato de Uranila;

Citrato de chumbo): materiais moderadamente eletrodensos.
 Microscopia Eletrônica de Transmissão
- A imagem é formada pela passagem diferencial do feixe de elétrons pela amostra.

- Componentes:
. Catodo: filamento de Tungstênio aquecido
. Anodo: transmite uma diferença de potencial 60 KV a 100 KV que impulsiona
os elétrons.

- Um sistema de magnetos funciona como lentes.

- Porta amostras (admite corte delgado em resina)

- Tela de visualização (monitor)

- Dispositivo para imagem (micrografia eletrônica)

Microscopia Eletrônica de Transmissão
Microscopia Eletrônica de Transmissão
 Microscópia Eletrônica de Varredura
- Os elétrons não atravessam a amostra, mas “varrem”
(escaneiam) a sua superfície; os elétrons refletidos são
coletados por um detector, processados para serem exibidos
em uma imagem.

- Muito embora o poder de resolução do ME de varredura

seja menor que o ME de transmissão, ele tem a vantagem
de fornecer imagens tridimensionais, pelo exame da
superfície das estruturas.
Microscópia Eletrônica de Varredura
Microscópia Eletrônica de Varredura

C í l i o s de células epiteliais Macrófago fagocitando hemácias

Aula prática: pranchas

Mitocôndria ao ME de transmissão
Aula prática: pranchas

Mitocôndria ao ME de varredura (após criofratura)

Aula prática: pranchas

Mitocôndria ao ME de transmissão (corte transversal)

 Aula prática: pranchas

Grânulos de Glicogênio ao ME de transmissão (rosetas eletrodensas)

 MET versus MO

MET MO