Conceitos de Microscopia Óptica

Conceitos de

Emile Barrias
Pesquisadora-Inmetro
História da Microscopia

Mikros Skopeo (olhar

(pequeno) +
através)
Greek
Origin
O olho humano e a formação da imagem
O olho humano e a formação de imagens
Qual é o menor material que podemos enxergar?

Por que não enxergamos tudo?

Por que existe um limite para o tamanho dos objetos
que podemos enxergar a olho nu?

• Lentes incapazes de modificar sua forma

• Distância de foco
Que instrumentos podem ser usados para
visualizar os objetos?

• 1280

• ~ 1600
Microscópios Rudimentares

• Irmãos Jansen

• Robert Hooke

• Antonie Van
Leewenhoek
9
Hooke publicou suas observações em um livro:
Micrographia

Foi o primeiro
a empregar o
termo célula

10
Leeuwenhoek foi o primeiro a observar e
descrever:

bactérias

protozoários

espermatozóides cortiça
Microscópios Ópticos Modernos
“Upright” Invertido

Ocular
Fonte de Luz

Ocular

Revolver

Objetivas Condensadora

Platina

FOCO -Micro e Platina

Condensadora
macrométrico Objetivas
Revolver
Fonte de Luz Charriot

Charriot
FOCO -Micro e macrométrico
Quais são as funções de um microscópio
óptico?

1. Produzir uma imagem magnificada do material

(MAGNIFICAÇÃO)

2. Separar detalhes na imagem (RESOLUÇÃO)

3. Tornar detalhes visíveis ao olho, câmera ou acessório

de imagem (CONTRASTE)
Magnificação (Aumento)

Objetiva X Ocular

60X X 10X

600 X de aumento
Resolução

• Capacidade de distinguir dois pontos como distintos

R= 0.61 x λ/N.A

• Quanto maior a abertura numérica, maior a resolução e

menor a distância de trabalho
Abertura Numérica

✓ Capacidade de uma lente de coletar luz

n = índice de refração
NA = n x sen α α = ângulo da iluminação
incidente
 Resolução
• Capacidade de distinguir dois pontos como distintos

R= 0.61 x λ/N.A

Exemplo 1: Exemplo 2 :
λ=500nm e NA=1.0 λ=500nm e NA=1.4
R=0.61x500/1 = 305nm R=0.61x500/1.4 = 217.8nm
305nm 217.8nm
Exemplo Real de Magnificação:
Contraste
• Luz: Energia chamada de radiação eletromagnética
(energia contida em fótons)
Microscopia de Campo Claro

núcleo

citoplasma

20 Células que revestem a mucosa

bucal
Campo Claro – amostra cortada em finas
lâminas e corada

21
22
23
24
Microscopia Óptica de Contraste
de Fase - Histórico

• 1932: Desenvolvimento (Zernike) e apresentação à

Carl Zeiss

• 1946: Introdução do mercado

• 1953: Prêmio Nobel de Física à Zernike

✓ Observação de células sem necessidade de

coloração prévia!
Microscópio de contraste de fase - Células
vivas sem coloração artificial

Duas ondas em
fase

brilho
“halo”
Duas ondas fora
de fase

escuro
Células que revestem a mucosa
bucal
Princípio de construção do Microscópio de
contraste de fase
Microscópio de contraste de fase
Alinhamento entre anel e placa de fase
Interação das Ondas em Microscopia
de Fase
• Onda S: Onda não desviada (não interage com o
material)
• Onda D: Onda difratada
• Onda P:Onda resultante (S+D)
Microscópio de contraste de fase - Células
vivas sem coloração artificial
Contrate Interferencial Diferencial
(DIC)
Polarização da Luz
• Papel do polarizador

• Todas as ondas vibram em um único plano

Birrefringência

http://www.microscopyu.com/tutorials/java/polarized/crystal/ind
ex.html
Princípio de construção do Microscópio
de contraste interferencial diferencial
Micrografia obtidas em microscópio
DIC

Spirulina Célula Epitelial Bucal Intestino de camundongo

36
Cianobactéria Hemácias

Efeito “sombreado”
E o que está abaixo do limite de resolução
do MO?
• Década de 50: Microscopia eletrônica
Fotoluminescência
✓ Processo no qual os elétrons são excitados por luz (fótons)
e re-emitem luz.

• Fluorescência X Fosforescência

Período entre excitação e emissão:+ de

10-6 s
Período entre excitação e
emissão:- de 10-8 s
Histórico
• 1852 - George Stokes - Cristais de fluorita (emissão do
Európio)

• 1904 - Kohler - Observou o fênomeno de fluorescência em

MO com UV

• 1911 - Oskar Heimstadt - Primeiro instrumento de MO de

fluorescência (concentrou luz UV suficiente para excitar a
fluo e barrar a emissão)

• 1950 – Cientistas acoplam Fitc a anticorpos (localização de

antígenos)
Relembrando o Espectro Eletromagnético
E como funciona o fenômeno de
Fluorescência: Diagrama de Jablonski
✓ O e- absorve energia salta um orbital maior (estado
excitado). Quando o e- volta ao estado original emite energia.
Desvio de Stokes
✓ O espectro de excitação tem um λ mais curto do que o
espectro de emissão (λ mais longo).

42
Microscópio de Epifluorescência
Cubo de Filtros – Tudo junto!

Reflete luz de excitação e transmite a emitida.

Corte longo
Passa faixa – duplo ou triplo
Por que usar microscopia de fluorescência?

➢ Visualização de estruturas invisíveis

em MO convencional

➢ Localização precisa do antígeno

➢ Múltiplas marcações

➢ Material vivo ou fixado

➢ Material em resina ou com cortes

congelados
O que preciso saber antes de me aventurar?

➢ Equipamento e reagentes caros

➢ Artefatos são comuns
➢ Rápido decaimento
➢ Conhecimento do “como fazer”
(pulos do gato)
➢ Há materiais que já são auto-
fluorescentes
➢ Há anticorpos que dão falsas reações
positivas
Material a observar: Autofluorescente

Artérias – Fibras elásticas

Material a observar: Autofluorescente

Tecido conjuntivo – Fibras colágeno

Material a observar: Autofluorescente

Vasos Sanguíneos
Mas nem sempre o material é autofluorescente. O que
fazer?
• Marcadores fluorescentes, anticorpos ou estratégias genéticas

Material de Interesse

Vivo Fixado

Marcadores Vitais Marcadores Não Vitais

Corantes de Organelas– Potencial mitocondrial
Marcadores Fluorescentes

JC-1 (Potencial mitocondrial)

JC-1 agregado (vermelho) Monômeros de JC-1 (verde)
Corantes de Organelas– Mitotracker
 Marcadores Fluorescentes
Corantes de Organelas– Lysotracker
• Base fraca que se acumula em
organelas com pH baixo
(protonada)
• Permeáveis
Imunofluorescência Anticorpos +fluorocromos
Marcadores Molecularas: Engenharia Genética
• GFP Green Fluorescent Protein (Prêmio Nobel de 2008)

• Shimomura
• Chalfie
• Tsien
Como funciona?

➢ Um único gene clonado e inserido em outro organismo

➢ A proteína, GFP emite luz verde ao ser estimulada

➢ GFP como um marcador genético luminoso para

diversos fenômenos biológicos
 O que pode ser
marcado com GFP?
Neurônios de mosca
➢ Utilidade: processos que
anteriormente não podiam ser vistos
• Como o desenvolvimento de células nervosas
no cérebro
• Como o células cancerígenas se espalham
pelo corpo
➢ É possível observar:
• Movimentos, posições e interações de
proteínas específicas
➢ O gene é sequenciado e acoplado ao promotor da
proteína de interesse
➢Quando injetado na célula, a proteína de interesse
fica fluorescente
Materiais espessos, o que fazer?
Microscopia confocal a laser
Plano de foco
Como imagens espessas são vistas em
epifluorescência
Microsopia Confocal - Histórico:
• 1950: Marvin Minsky – Conceito básico de microscopia
confocal
Microscópio Confocal - Protótipo
Microscópio Convencional X Microscópio Confocal
Microscópio Convencional X Microscópio Confocal
Microscópio Confocal: Resolução Lateral e Axial

• O papel do pinhole
Microscópio Óptico de Varredura Confocal à Laser
Moderno
Confocal a Laser
1. Computador acoplado

2. Laser (“varre” a amostra)

3. Faz cortes virtuais (ópticos)

4. Foca num único ponto, imagem sem ruído

5. Faz reconstruções tridimensionais

Fatias Ópticas e Reconstrução Tridimensional
 FRAP
Fluorescence recovery after
photobleaching
Fotobranqueamento pontual
Retorno de fluorescência
Initial Fluorescent signal

Bleach

Recovery
Microscopias de Super Resolução
Microscopias de Super Resolução

• A resolução é limitada
por difração. Ernst Abbe (1840-1905)

• Abbe (1873) : a menor

distância resolvível
entre dois pontos (d)
nunca pode ser menor
que a metade do
comprimento de onda
usado (MO - ~ 200 nm)
Super Resolução ou Nanoscopia
Super Resolução ou Nanoscopia
O conceito Resolft (“Reversible Saturation –
or switchable- Optical Fluorescence
Transition)
• “Não podemos distinguir a fluorescência de duas moléculas
próximas (250 nm) por que elas acendem ao mesmo tempo”.
 3D GSD – Imagens Obtidas e como
preparar

https://www.leica-microsystems.com/science-
lab/video-tutorial-how-to-optimize-sample-
preparation-for-gsd-microscopy/