1. TEMA Tcnica de Microscopia 2. INTRODUO 2.1.

Histrico

Desde a antiguidade povos como os egpcios, gregos e romanos conheciam a arte de talhar e polir cristais de rochas e usam essas primeiras lupas primitivas como objetos decorativos.

No entanto, somente em meados do sculo XIII, um monge chamado Alejandro Spina divulgou o segredo e a construo da fabricao de lentes corretivas. Os primeiros estudos cientficos datam do sculo XVII conduzidos por Johanes Kepler que estudou os fenmenos ticos e a formao de imagens no olho.

Atansio Kircher (1601-1680) foi o primeiro a usar a palavra microscopium nome dado ao microscpio daquela poca (Gato, 2005). Muitos atribuem a inveno do microscpio a Galileu, porm foi Antonie van Leeuwenhoek, (1632-1723), quem realmente aperfeioou o instrumento e o utilizou na observao de seres vivos. Seu microscpio era dotado de apenas uma lente de vidro, permitindo um aumento de at 300 vezes. Com este instrumento Leeuwenhoek estudou os glbulos vermelhos do sangue e constatou a existncia dos espermatozoides (Embrapa, 2005). Robert Hooke, em 1665 publicou seu livro intitulado Micrographia onde descreveu o microscpio e como ele havia descoberto a circulao do sangue nos peixes. Em seu microscpio, Robert Hooke incorporou o ajuste fino e acrescentou mais uma lente (Embrapa, 2005).

Aps o aprimoramento, os microscpios ficaro constitudos por 2 sistemas de lentes de cristal (oculares e objetivas) que produzem ampliaes de imagem que vo em geral de 100 a 1000 vezes (Embrapa, 2005).

Em 1932, surgiu o microscpio eletrnico permitindo aumentos de 5 mil a 500 mil vezes. A diferena bsica entre os microscpios tico e eletrnico que neste ltimo no utilizada a luz, mas sim feixes de eltrons. No microscpio eletrnico no h lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes eletromagnticas. Estas lentes ampliam a imagem gerada pela passagem do feixe de eltrons no material e a projetam em uma tela onde formada uma imagem de pontos mais ou menos brilhantes. No entanto, impossvel observar material vivo neste tipo de microscpio. O material a ser estudado passa por um complexo processo de desidratao, fixao e incluso em resinas especiais, muito duras, que permitem cortes ultrafinos por meio das navalhas de vidro de ultramicrtomo (Embrapa, 2005).

Adicionalmente, o microscpio apresenta uma base mecnica (base, brao, revlver, platina, charriot, parafusos macro e micromtrico e parafuso de regulagem do condensador) e um sistema de iluminao (fonte luminosa, diafragmas, condensador e filtros) (Figura 1). O p ou Base suporta o microscpio, assegurando a sua estabilidade; brao ou Coluna pea fixa base, na qual esto aplicadas todas as outras partes constituintes do microscpio; Tubo ou Canho cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revlver com objetivas; Platina pea circular, quadrada ou retangular, paralela base, onde se coloca a preparao a observar, possuindo no centro um orifcio circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador; Parafuso Macromtrico engrenagem que suporta o tubo e permite a sua deslocao a da platina, indispensvel para fazer a focagem; Parafuso Micromtrico imprime ao tubo ou platina movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscpio; Revlver disco adaptado zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de diferentes ampliaes: por rotao possvel trocar rpida e comodamente de objetiva (Reis, 2003).

Figura 1. Partes constituintes do microscpio de luz, em que (A) compem o sistema tico e (B) o sistema mecnico (Reis, 2003).

2.2.

Microscopia de campo claro

O microscpio de campo claro o mais comum microscpio de luz (Melo, 2002). Nesse microscpio, o campo de viso aparece iluminado e os objetos que esto sendo observados apresentam-se mais escuros (Reis, 2003).

Segundo Weiss et al. (1991), a microscopia de campo claro apresenta algumas vantagens como menor toxicidade por necessitar de menores concentraes de corantes; baixo contraste, devido ao uso de baixas concentraes de cromforos naturais ou especialmente corantes vitais, pode ser grandemente aumentados; observaes feitas no comprimento de onda de mxima absoro aumentam o contraste. Entretanto, apresenta algumas limitaes como objetos de fase exibem mnimo contraste em foco e mostra contraste oposto por cima e abaixo do foco.

2.3.

Microscopia de campo escuro

Microscpio utilizado para visualizar materiais muito pequenos como plncton, bactrias e cristais (Melo 2002). As imagens obtidas no campo escuro apresentam grande contraste e este pode ser ampliado pelo uso de sinal de vdeo (Weiss et al., 1991).

Baseia-se no princpio de que a luz dispersa pela superfcie dos materiais que possuem diferentes ndices de refrao. A luz dispersada entra na objetiva e o objeto aparece iluminado e brilhante sobre um fundo escuro. Tal conseguese pela utilizao de um tipo especial de condensador que ilumina o objeto obliquamente (Reis, 2003). A luz atinge o espcime a ser analisado e somente os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema, isto , objetivas e oculares, formando a imagem (Taboga, 2001). 3. OBJETIVO Avaliar os microorganismos que exibem algum dado morfolgico caracterstico, em estado vivo e em suspenso aquosa. 4. Materiais e Reagentes 4.1. Reagentes

Soluo de Hidrxido de Potssio 5%; gua Destilada; Meios de cultura com cultura isolada ou no; Amostras liquidas isoladas ou no; Yakult. 4.2. Aparelhagem

Lmina; Lamnula; Basto de borossilicato ou vidro neutro com dimenses adequadas ao uso; Ala de platina ou nquel cromo; Bico de Bunsen; Microscpio ptico com condensador de campo escuro seco, permitindo aumentos de 400; Estereoscpico com aumento de 40 X.
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5. Procedimentos

5.1.

Preparao da soluo de Hidrxido de Potssio

Pesar 1,2575 gramas de Hidrxido de Potssio PA Dissolver a massa em 10 mL de gua destilada transferir para um balo volumtrico de 25 mL e homogeneizar a amostra.

5.2.

Microscopia Direta: Amostras sem turvao

Homogeneizar a amostra de Yakult transferir para um tubo com tampa e centrifugar a alquota de 9,5 ml de Yakult em aproximadamente 3000 rpm por 10 minutos. Esperar a alquota decantar, desprezar o sobrenadante e com o restante do liquido suspender o resduo. Flambar a ala de platina e esfriar. Transferir aladas do sedimento para lmina e cobrir com a lamnula e observar no microscpio, utilizando campo escuro. 5.3. Microscopia Direta: Amostra com turvao

Homogeneizar a mostra de Yakult. Flambar a ala de platina e esfriar. Cobrir com a lamnula e observar no microscpio utilizando campo escuro. 5.4. Microscopia Direta: Amostra com placa de petri

Flambar a ala de platina e esfriar no gel contem as colnias a ser analisada. Colocar em Lamina com ajuda da ala uma colnia. Adicionar na Lamina uma gota de KOH e cobrir com a lamnula. Observar no microscpio utilizando campo escuro. 5.5. Contagem das Placas

Utilizar um equipamento de contagem de placas para averiguar quantas colnias contm em cada placa. 6. Resultado e Discusso
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Partir da anlise microscpica do leite fermentado in natura pde-se observar a presena de trs microrganismos. O bacilo longo, pela similitude morfolgica sugere o Lactobacillus bulgaricus conforme referencias bibliogrficas citadas no referencial bibliogrfico. O segundo, um bacilo de morfologia bifurcada em forma de Y e V, ou como bastonete apresentando uma das extremidades dilatadas, Bifidobacterium e o terceiro, cocos em forma de cadeia, espcie provvel Streptococcus thermophilus. Na primeira anlise do fermentado sem turvao observa-se a motibilidade negativa, ou seja, o crescimento s ser observado no local de inoculao. J na segunda anlise percebe-se que a turvao observa-se a motibilidade dos bacilos positiva, ou seja, quanto mais turvo o meio mais clulas do microorganismo se encontram nesta amostra. No modo de iluminao de campo escuro a luz direcionada para o exterior do cone que a objetiva compreende para iluminar a lmina obliquamente. Somente a luz que refletida ou difratada pelas caractersticas da amostra entra na objetiva. Assim, a amostra aparece como um fundo preto com as caractersticas refletidas ou difratadas aparecendo com brilho. A iluminao de campo escuro aumenta a visibilidade de detalhes que so frequentemente ignorados pela iluminao de campo claro. Mesmo detalhes estruturais pequenos, que se encontram abaixo do limite de resoluo da objetiva, so visveis com campo escuro (esta maior visibilidade, que mais parecida com a observao das estrelas mais distantes noite, no um aumento na resoluo). A microscopia de campo escuro uma tcnica excelente para uma varredura rpida, com um amplo campo de viso, para partculas, ranhuras ou resduos qumicos. No sistema de iluminao um fator importante o contraste, que est diretamente ligado com a qualidade da imagem e depende de vrios fatores importantes. Na terceira analise observou-se diferentes formas e tamanhos conforme se pode observar na tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Analise de amostra de microorganismos. Contagem Amostra Colnia 3AB 2AB 4 4 100 6 5 3 de Formato Esfrica Cilndrica Bastonetes Bacilos

Normalmente, as colnias de microrganismos se originam somente de uma clula ou esporo de microrganismo. Essas colnias apresentam caractersticas morfolgicas diferentes, as quais permitem a distino entre os

microrganismos, como mostra a tabela 1. No entanto, para conseguir uma visualizao das colnias independentes no meio slido, necessria a distribuio uniforme das bactrias sobre a placa de Petri. Quando se coloca o KOH na amostra de s-la analisada para clarear, a tcnica usada para pesquisa de fungos (leveduriformes e particularmente filamentosos) em material biolgico na presena de muco, restos celulares, plos, unhas, etc., por facilitar a microscopia dissolvendo a queratina e o muco, destacando as estruturas fngicas, quando presentes. Quando o hidrxido de potssio entra em contato com o microorganismo em presena de oxignio e tornasse numa colorao azul que neste microorganismo possui acetona e com adio do hidrxido ocorre a reao de oxidao da acetona para o diacetil. Como se pode perceber em uma das amostras analisadas quando o KOH entrou em contato com o microorganismo observou-se a formao de um fio quando se passava a platina sobre a lmina isso ocorre devido se a bactria for verdadeiramente Gram-negativa, o KOH ir romper sua parede celular e liberar seu DNA que ser observado como fios viscosos. Se a bactria for Grampositiva no haver a formao de fios.

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7. Concluso A tcnica de microscopia demonstrou a importncia de se avaliar os microorganismos principalmente se nos futuros engenheiros trabalhamos em uma indstria de alimentos pois qualquer forma microbiana pode interferir no processo de fabricao e comprometer a sade humana. Percebemos que atravs de tcnica simples podemos diminuir grandes prejuzos com esses microorganismo no nosso processo. 8. Referncias Bibliogrficas. MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J. Microbiologia de Brock. So Paulo: Prentice Hall, 2004.

PELCZAR, M.J., CHAN, E.C.S., KRIEG, N.R. Microbiologia. So Paulo: Makron Books, 1996. Volumes 1 e 2.

William Callister Jr. Introduo Cincia e Engenharia dos Materiais 2da Ed.

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