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DESCRIÇÃO
Princípios e características da microscopia de luz. Componentes mecânicos e ópticos do
microscópio. Características da objetiva, diferença entre poder de ampliação e poder de
resolução. Utilização correta do microscópio e os tipos de microscopia de luz existentes.
PROPÓSITO
Compreender os princípios que regem a microscopia de luz e os componentes do microscópio,
bem como suas funções e as diversas modalidades de observação. Obter conhecimentos
suficientes para a correta utilização deste equipamento e o esclarecimento sobre as
possibilidades de aplicação da microscopia na pesquisa e no diagnóstico.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
MÓDULO 2
INTRODUÇÃO
A palavra microscópio vem da junção das palavras gregas mikrós , que significa pequeno, e
skoppéoo , que significa observar. A maioria dos conhecimentos atuais sobre a Microbiologia
e a Biologia Celular é resultado do desenvolvimento das técnicas de microscopia, que utiliza a
luz (visível ou não) para gerar uma imagem.
Por fim, vamos conhecer um pouco sobre os principais tipos de microscopia de luz, seus
princípios de funcionamento e suas principais aplicações. Vamos começar?
MÓDULO 1
Porém, o nome do inventor e a data exata da criação do primeiro microscópio ainda é motivo
de dúvida. Alguns historiadores sugerem que o primeiro microscópio tenha surgido no final do
século XVI com o trabalho do fabricante de óculos Zacharias Janssen, que, ao unir duas lentes
em um mesmo eixo, conseguiu visualizar estruturas pequenas e simples. Outras teorias
históricas apontam que Galileu observava, já em 1623, minúsculas partículas com um
telescópio rudimentar.
Porém, foi em 1665 que Robert Hooke construiu o equipamento que mais se assemelha aos
microscópios de luz utilizados atualmente. No seu livro, Micrographia , Hooke apresentou a
descrição de suas observações a partir de um microscópio que se baseava na ampliação da
imagem pela combinação de uma lente ocular com uma objetiva. Nesse documento, há o relato
da observação de cortes de cortiça e a primeira citação do termo “células”. Paralelamente, o
holandês Anton van Leeuwenhoek construiu um microscópio e fez observações a partir da
análise de uma cortiça e de microrganismos coletados na água da chuva.
Ao longo dos séculos, a microscopia se aperfeiçoou e hoje nos permite observar os detalhes
mais profundos da estrutura celular nas diferentes formas de vida. Realmente, os microscópios
atuais são muito mais complexos do que os do século XVI, mas seguem o mesmo princípio ao
associarem lentes a fim de gerar uma imagem ampliada.
Muitas são as aplicações dos diversos tipos de microscopia. Talvez nenhuma invenção tenha
revolucionado tanto a ciência como o microscópio, que permitiu a quebra de paradigmas
científicos e impulsionou o campo da Biologia Celular.
A luz pode ser descrita como uma onda ou um fluxo de fótons, dependendo do fenômeno
que desejamos descrever. Dentro da microscopia de luz, um conceito importante é o espectro
da luz, ou seja, os comprimentos de onda. Esse espectro não se limita ao domínio visível,
indo desde ondas de rádio à radiação gama. A luz que enxergamos está dentro de uma faixa
pequena desse espectro, a região visível, que varia do vermelho ao violeta.
Quando observamos a luz branca, por exemplo, vemos na verdade a soma de todos os
comprimentos de onda que fazem parte da região visível do espectro. A microscopia de luz se
interessa justamente por essa região. Porém, em alguns microscópios, a fonte de luz é dada
por lâmpadas de mercúrio, as quais emitem luz que ultrapassa o espectro visível.
FÓTONS
Além das características da luz, precisamos conhecer dois fenômenos físicos de interferência
na luz que são importantes na formação da imagem final: a refração e a difração. Estudando
esses dois fenômenos vamos entender, por exemplo, a capacidade de resolução de uma lente
e a utilização dos meios de imersão.
Por exemplo, um lápis dentro de um copo com água parece estar torto ou distorcido. O que
ocorre, na realidade, é um desvio da luz ao mudar de um meio para outro (do ar para a água),
pois os índices de refração desses dois meios são diferentes. Na microscopia, o
conhecimento do fenômeno da refração é importante para entender por que utilizamos meios
de imersão para lentes objetivas e qual o impacto deles na geração e qualidade da imagem.
REFRAÇÃO
Refração é a mudança na velocidade de uma onda ao atravessar dois meios com índices
de refração diferentes. Por sua vez, o índice de refração mede a razão entre a velocidade
da luz no vácuo, onde não há nenhuma perturbação, e a velocidade da luz em um
determinado meio.
As ondas de luz, emitidas a partir de uma fonte luminosa, tendem a seguir uma trajetória em
linha reta. No entanto, conforme vemos na figura a seguir, a existência de uma parede com
fendas faz com que a luz se espalhe formando cones de iluminação que, na realidade,
representam a luz difratada. Logo, difração é a capacidade das ondas de desviar ou contornar
os obstáculos que encontram durante sua propagação, bem como seu espalhamento ou
alargamento após atravessar fendas ou orifícios.
Figura 1: Esquema representando o fenômeno de difração da luz.
Esse fenômeno parece complicado e longe da prática da microscopia, não é? Mas vamos
trazer para a nossa realidade para entendê-lo melhor.
Podemos comparar a “parede com fendas” com uma lâmina contendo algum corte de tecido
biológico, onde diferentes estruturas celulares terão maior e menor capacidade de interferir na
penetração da luz. Em geral, a fonte de luz dos microscópios fica na base do aparelho, logo, o
feixe de luz atravessa a amostra e permite a formação da imagem desta. A resolução de uma
lente, portanto, é dada pela sua capacidade de captar os raios que foram difratados.
Fonte: Chokniti Khongchum/Shutterstock.
No microscópio óptico, o feixe luminoso atravessa a amostra e permite a geração da
imagem que visualizamos.
APRESENTAÇÃO DO MICROSCÓPIO
Um microscópio pode ser dividido em dois principais sistemas: o mecânico e o óptico.
Conhecer o nome de cada parte e a sua respectiva função é importante para manusear de
maneira adequada esse equipamento tão essencial para as ciências biomédicas.
O sistema mecânico é composto por diferentes partes que têm funções específicas e
distintas.
Pé ou base - confere suporte e apoio para sustentar o microscópio sobre uma superfície.
Veremos agora quais elementos compõem a parte óptica de um microscópio. Essa talvez seja
a parte mais interessante do aparelho, pois é nela que os mistérios envolvidos na formação e
aumento da imagem são descobertos.
Lentes oculares – também ampliam com resolução a imagem gerada pela objetiva.
VOCÊ SABIA
Ajuste dioptria refere-se ao ajuste da ocular para promover acomodação para as diferenças de
visão do observador.
Fonte: O autor.
Figura 2: Apresentação dos componentes básicos de um microscópio de luz convencional.
Você deve estar se perguntando como observar uma garrafa de cultura de célula, já que
algumas não cabem no espaço entre a platina e a objetiva, pois são muito altas. Nesses casos,
nós utilizamos os chamados microscópios invertidos, nos quais a fonte de iluminação fica
acima da platina e, as objetivas, abaixo dela.
Ao contrário do que se imagina, uma lente é composta por um complexo sistema óptico que,
através da convergência e divergência dos raios luminosos, consegue ampliar a imagem. Uma
objetiva contém em sua parte externa diferentes códigos e números que indicam todas as suas
características e especificações. É importante que você aprenda a identificar essas
informações, pois elas darão dicas de como você deve utilizar o microscópio e observar sua
amostra.
VOCÊ SABIA
Talvez você não saiba o significado de algumas dessas informações, mas vamos ver uma por
uma:
FABRICANTE (1)
Nome da empresa responsável pela produção da lente objetiva. No caso do nosso exemplo, a
empresa é a Zeiss.
DENOMINAÇÃO (2)
Compreende a classe e o tipo de correção da lente. É interessante saber que ocorrem dois
tipos de aberrações nas objetivas: esférica e cromática. Alguns recursos são utilizados para
corrigir essas aberrações e melhorar a qualidade da imagem gerada. De modo geral, os
fabricantes adotam uma nomenclatura única, facilitando o entendimento do operador do
microscópio. Vejamos a seguir as principais especificações encontradas no campo da
denominação (Quadro 1).
ESFÉRICA
CROMÁTICA
Surge do fato de que os raios luminosos de diferentes comprimentos de onda não estão
focados no mesmo ponto do eixo óptico.
DENOMINAÇÃO ESPECIFICAÇÃO
Ao observamos a Figura 3, vemos que a objetiva é uma EC, própria para microscópios de
fluorescência. Epiplan indica que é utilizada para luz refletida e Apochromat significa que
essa objetiva corrige tanto aberrações esféricas quanto cromáticas para quatro cores.
ATENÇÃO
Você não precisará calcular a AN, pois o valor está escrito na lente. Entretanto, deve entender
os fundamentos do cálculo. A AN é dada pela fórmula:
AN = n (sen µ)
Então, quanto maior o valor de AN, maior também o poder de resolução e a necessidade de
uso de um meio de imersão, pois menor será o espaço entre a lente e a lamínula (distância de
trabalho).
A escolha da abertura numérica para melhorar a resolução da objetiva está muito ligada à
magnificação desta. Em uma objetiva de 40x, por exemplo, uma AN de 0,75 é baixa, sendo
ótimo o intervalo entre 1,2 e 1,4. Por outro lado, AN de 0,25 em uma objetiva de 10x é baixa,
sendo recomendada uma 0,45. Não existe, por exemplo, uma objetiva de 10x com uma AN de
1,2. Desse modo, por uma questão física e trigonométrica, o intervalo de AN ideal para suas
análises terá que ser analisado juntamente com a magnificação dada pela sua objetiva.
POLARIZAÇÃO
null
Fonte: Adaptado de The Biology Primer.
Figura 4: Demonstração da refração sofrida pela luz ao passar por diferentes meios no
microscópio.
As objetivas que necessitam de algum tipo de meio de imersão terão a indicação através de
uma faixa de cores que representarão um meio específico. Vejamos os principais (Quadro 2):
Quadro 2: Faixa de cor da objetiva e tipo de substância utilizada como meio de imersão.
Glicerina
Água
Fonte: O autor.
Fique atento à indicação de cor na objetiva, pois o uso do meio de imersão incorreto pode
resultar na perda significativa de qualidade na imagem ou até mesmo danificar a objetiva.
ATENÇÃO
O código de cor encontrado em algumas objetivas indica o meio de imersão que deve ser
utilizado, como as cores preta, laranja, branca e vermelha. Outras cores podem ser
encontradas, mas essas estão relacionadas ao tamanho da ampliação. Isso é muito útil quando
você tem um revólver contendo várias objetivas e deve selecionar rapidamente uma ampliação
específica. Como no exemplo dado (figura 3), o código de cor azul presente na objetiva indica
que a ampliação é de 60x.
null
Fonte: Adaptado de Soleil Nordic/Shutterstock.
Figura 5: Esquema da montagem lâmina – amostra – lamínula.
Fonte: O autor.
Figura 6: O aumento da resolução permite a distinção de dois pontos com maior clareza.
Poder de resolução não é a mesma coisa que poder de aumento. Se você ampliar uma foto
várias vezes, as estruturas separadas por menos de 0,2 micrômetros vão continuar
aparecendo como um ponto só, como se fossem um único borrão. Nesse caso, haverá um
aumento do poder de ampliação, mas não de resolução. O surgimento dos microscópios
permitiu ao ser humano aumentar tanto o poder de ampliação quanto o de resolução das
imagens.
COMENTÁRIO
IMAGEM A
IMAGEM B
IMAGEM C
IMAGEM D
IMAGEM E
IMAGEM A
IMAGEM B
IMAGEM D
Quase terminando, abra o diafragma de campo até que a luz ocupe o seu campo visual, mas
sem ultrapassar muito.
IMAGEM E
Por fim, retire com muito cuidado uma das oculares para a correta observação do diafragma do
condensador, que deve estar aberto em cerca de 80% do campo.
Agora sim, tudo pronto! A imagem resultante terá contraste e iluminação excelentes.
Fonte: O autor.
Figura 7: Algumas etapas da iluminação de Kohler.
COMO UTILIZAR UM MICROSCÓPIO?
Como você deve saber, o microscópio é um equipamento muito utilizado em diversos
laboratórios, auxiliando tanto na pesquisa quanto no diagnóstico e na educação. Apesar disso,
ele é um equipamento sensível e caro.
Você foi apresentado aos principais componentes e aprendeu suas respectivas funções. Esse
conhecimento é importante para que você manuseie um microscópio da maneira adequada.
Apenas com o domínio dos procedimentos básicos de operação, você poderá alcançar todos
os recursos do equipamento, além de mantê-lo funcionando por mais tempo.
Nunca se deve manusear um microscópio com as mãos sujas ou molhadas e nem forçar
nenhuma das partes, pois todas devem funcionar suavemente. A lente da objetiva, seja de
maior ou de menor aumento, nunca deve encostar na lâmina ou lamínula. Ou seja, você não
pode focalizar a imagem levantando a platina com o macrométrico e olhando na ocular ao
mesmo tempo.
As lentes devem ser limpas com uma solução de álcool-éter (proporção 9:1) e um papel
absorvente bem macio. Não toque nelas diretamente com as mãos. Enquanto não estiver
observando sua amostra, evite deixar a fonte de luz ligada.
Com essas recomendações básicas, agora vamos aprender como observar corretamente uma
amostra no microscópio.
Fonte: O autor.
Figura 8: Etapas para a utilização de um microscópio óptico.
Lembre-se de que, para algumas atividades, você vai utilizar as objetivas que necessitam de
um meio de imersão. Nesses casos, alguns cuidados adicionais devem ser adotados. Com
auxílio de um papel bem macio, delicadamente, seque o óleo de imersão da objetiva. Seja
muito delicado, pois você pode acabar arranhando a lente. Em seguida, utilize a solução de
álcool-éter comentada anteriormente para retirar os resquícios do óleo.
INTRODUÇÃO À MICROSCOPIA DE LUZ:
CONHECENDO O MICROSCÓPIO NA
PRÁTICA
VERIFICANDO O APRENDIZADO
GABARITO
Os meios de imersão são utilizados para diminuir a diferença de velocidade da luz entre dois
meios, aproximando os seus índices de refração (IR). Dependendo do IR de alguns meios, a
luz pode passar mais rapidamente ou lentamente, desviando os raios de luz. Essa diferença
diminui a qualidade da imagem.
MÓDULO 2
Identificar as diferentes modalidades de observação em microscopia de luz
Na microscopia de campo claro, temos uma fonte luminosa de onde parte a luz. Essa luz é
concentrada pelo condensador, que aumenta a intensidade luminosa e a tornará uniforme na
amostra. Saindo do condensador, a luz interage com a nosso espécime e é coletada pela
objetiva, que forma uma imagem ampliada. Essa imagem é novamente ampliada, agora, pelas
lentes oculares e, finalmente, chega aos nossos olhos.
Fonte: O autor.
Figura 9: Mecanismo simplificado de funcionamento do microscópio de campo claro.
A partir da utilização das lentes objetivas e oculares que aumentam a imagem com resolução,
observamos estruturas mais detalhadas que não conseguiríamos enxergar a olho nu. O fundo
da imagem que vemos é branco, daí o nome campo claro.
Fonte: O autor.
Figura 10: Tecidos biológicos corados com diferentes corantes.
Você consegue notar que as imagens anteriores possuem cor? Como isso foi possível?
Isso acontece porque, para observarmos alguma amostra nesse tipo de microscopia, é
necessário que ela possua cor própria... ou que adicionemos algum corante a ela. Por quê?
As amostras que costumam ser submetidas à visualização por microscopia de campo claro são
muito finas, delgadas, para permitir a interação com a luz. Assim, o contraste que elas
oferecem é muito baixo. A adição de corantes oferece um maior contraste entre as estruturas,
possibilitando sua correta observação.
Fonte: O autor.
Figura 11: Corte de fígado sem corante (à esquerda) e corado com hematoxilina e eosina (à
direita).
A microscopia de campo claro é muito utilizada em laboratórios de análises clínicas e de
pesquisa, contribuindo enormemente para os estudos de parasitologia, microbiologia, histologia
e biologia celular de modo geral.
VOCÊ SABIA
Dependendo da estrutura a ser analisada, existe uma coloração específica? A lista é bem
grande, mas vamos ver duas delas:
MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO
Você já observou o que acontece quando um raio de luz passa através de certas substâncias,
como um cristal? Esse raio é dividido, gerando outros. A microscopia de polarização permite
que essas substâncias com capacidade de desviar a direção da luz, chamadas de
birrefringentes, possam ser analisadas.
RESPOSTA
Porque esses materiais birrefringentes possuem dois diferentes índices de refração para
direções de propagação da luz distintas. As substâncias birrefringentes podem estar
naturalmente presentes nos tecidos biológicos ou podem ser adicionadas às amostras através
de métodos tintoriais.
VOCÊ SABIA
Além dos lindos cristais, podemos encontrar a birrefringência em materiais que estão presentes
no nosso dia a dia? O papel celofane, alguns itens plásticos, a fita adesiva e até fios de cabelo
podem ser úteis para observar essa característica óptica!
EXEMPLO
A luz do sol, por exemplo, é uma luz não polarizada, que possui várias direções.
Fonte: Adaptado de Kirill Borisenko/Wikimedia/licença(CC BY-SA 3.0).
Esquema do fenômeno de polarização da luz.
Essa luz polarizada, então, incide na nossa amostra com características birrefringentes e é
dividida em dois feixes, que são desviados. Dentro do tubo do microscópio, entre a lente
objetiva e a ocular, encontramos um segundo prisma, que é chamado de analisador. A função
dele é bloquear a passagem da luz incidente que não foi desviada e selecionar apenas a luz
desviada pela amostra birrefringente (Figura 12).
Fonte: O autor.
Figura 12: Mecanismo simplificado do funcionamento do microscópio de polarização.
É importante destacar que, para a realização da microscopia de polarização, é necessário que
o polarizador e o analisador estejam alinhados, formando um ângulo reto que resulta em um
fundo escuro.
COMENTÁRIO
Caso eles não estejam alinhados, permitindo a passagem seletiva dos raios desviados, não
conseguimos ver absolutamente nada.
Vamos imaginar que estamos em um laboratório e queremos analisar uma fatia de borracha e
uma amostra biológica com características birrefringentes. Para isso, será utilizada a
microscopia de luz polarizada.
Quando a amostra é a fatia de borracha, não vamos conseguir observar nada. Isso ocorre
porque a borracha não é refringente, assim os raios de luz não foram divididos pelo objeto,
mesmo quando colocamos a amostra na platina do microscópio, com os prismas alinhados
formando o fundo escuro. O mesmo ocorre quando as amostras não são refringentes.
Porém, ao analisarmos uma amostra biológica, que seja cristalina ou birrefringente, como
fibras musculares, gotículas de gordura ou espermatozoides, teremos uma imagem
sensacional! A partir do ajuste dos prismas e sob o efeito da luz polarizada, os componentes
birrefringentes dessa amostra desviarão a luz e a imagem final terá um brilho incrível, onde nós
conseguiremos ver com detalhes os realces, em detrimento dos que não são birrefringentes.
Fonte: Lebendkulturen.de/Shutterstock.
Músculos da Daphnia pulex (Piolho D`água).
VOCÊ SABIA
A birrefringência de algumas amostras pode ser intensificada através do uso de corantes, como
é o caso das fibras de colágeno, que podem ser mais evidenciadas se coradas por Picrosírius.
Outro exemplo é o Azul de Toluidina, que evidencia a cromatina e a matriz extracelular.
Durante muito tempo, a maioria dos detalhes de células vivas não pôde ser observada pelo
microscópio de campo claro comum. Isso porque, as estruturas celulares são transparentes e
não apresentam contraste suficiente para serem visualizadas.
Para resolver esse problema, o físico holandês Zernike inventou o microscópio de contraste de
fase e, por conta da sua importância, recebeu o prêmio Nobel de física, no ano de 1953.
A microscopia de contraste de fase permite que possamos visualizar, com detalhes, amostras
vivas, não fixadas e não coradas. Mas antes de entendermos o mecanismo de funcionamento
desse microscópio, precisamos conhecer seus principais componentes.
Parece complexo, não é? Mas você vai ver que é mais simples do que você imagina!
Fonte: Adaptado de CNX OpenStax/Wikimedia/licença(CC BY 4.0).
Figura 13: Componentes do microscópio de contraste de fase.
A microscopia de contraste de fase baseia-se no fato de que a luz difratada (desviada) possui
um atraso em relação à luz não difratada. Então, quando passam pela nossa amostra, os raios
difratados apresentam uma diferença de velocidade (cerca de ¼) em relação aos raios não
difratados.
Imagina que você tem uma amostra biológica viva, bem delgada, e liga o microscópio de
campo claro comum para emitir luz nessa amostra. Você vai ver uma imagem com um
contraste muito baixo, pois boa parte da luz vai difratar, sem atingir a amostra.
RESPOSTA
Atrasando ou acelerando esses raios que não foram difratados! E é justamente aí que entram
os anéis de fase, tanto do condensador quanto da objetiva: eles basicamente aceleram ou
retardam esses raios, gerando diferenças de intensidade luminosa e aumentando a interação
entre eles, resultando na melhoria considerável no contraste da imagem. Para alcançar esse
objetivo, primeiro, devemos regular o microscópio, selecionando os anéis de fase (no
condensador e na objetiva).
Para que a fase seja ajustada, retiramos cuidadosamente uma das oculares e alinhamos um
anel de fase com o outro, a área sombreada de um com a do outro. Na imagem final, as partes
mais escuras correspondem a áreas mais densas da amostra, e as partes mais claras
correspondem a áreas menos densas.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE
DIFERENCIAL DE INTERFERÊNCIA
A microscopia de contraste diferencial de interferência (DIC) foi desenvolvida pelo físico
Georges Nomarsky em 1952, um ano antes do cientista que inventou a microscopia de
contraste de fase ganhar o Prêmio Nobel.
Utilizando o microscópio de DIC, podemos observar amostras não coradas, vivas, com um alto
contraste e com um diferencial: uma sensação de profundidade! Se tivermos amostras mais
grossas, que não conseguiríamos visualizar no microscópio de contraste de fase, podemos
utilizar a microscopia de DIC.
RESPOSTA
Vamos agora entender como isso é usado para gerar a imagem final:
Depois que interagiram com a nossa amostra, é hora de juntarmos novamente esses feixes.
Quem faz isso é um segundo prisma situado próximo da objetiva. Em seguida, um analisador
seleciona os feixes que sofreram mudança de angulação, por conta dos diferentes índices de
refração. Juntando tudo, a combinação e a interação de todos esses feixes, que alcançaram
áreas diferentes da nossa amostra, criam uma imagem de alto contraste.
Fonte: O autor.
Figura 14: Esquema simplificado do microscópio de contraste diferencial de interferência.
Observe as imagens abaixo. Você consegue perceber as principais diferenças entre elas?
Conseguimos ter uma sensação de textura e profundidade na microscopia de DIC e não vemos
o halo de fase (indicado pela seta), característico da microscopia de contraste de fase.
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
Você sabia que algumas substâncias apresentam naturalmente característica fluorescente?
Isso acontece porque, quando elas são excitadas por uma determinada fonte de energia,
emitem luz. Como assim?
Vamos tentar entender melhor com o esquema abaixo, mas antes precisamos nos lembrar de
um conceito da física: o comprimento de uma onda é inversamente proporcional à sua energia,
ou seja, quanto maior o comprimento de onda, menor a energia.
Fonte: O autor.
Figura 16: Representação do diagrama de Jablonski, esquematizando o fenômeno da
fluorescência.
O primeiro microscópio de fluorescência foi construído por August Köhler no início do século
XX.
Porém, foi somente meio século depois, com o desenvolvimento de anticorpos ligados a
moléculas fluorescentes (os chamados Fluorocromos ou Fluoróforos), que a microscopia de
fluorescência pode ser amplamente aplicada nos laboratórios.
ATENÇÃO
Agora que entendemos como ocorre a excitação dos Fluorocromos e posterior emissão de luz,
vamos conversar um pouco mais sobre como funciona a microscopia de fluorescência.
No microscópio de fluorescência, vamos notar que o caminho óptico, aquele feito pela luz, é
diferente do que vimos nos tipos anteriores de microscópio. Aqui, os raios luminosos passam
pelo condensador e pela objetiva, antes de chegarem à amostra. Logo, o caminho que a luz faz
para chegar à amostra é o mesmo da luz que é emitida pela amostra.
A luz sai de uma lâmpada policromática e passa pelo condensador, que concentra os raios
luminosos. Em seguida, esses raios passam por um filtro de excitação, que seleciona e deixa
passar apenas o comprimento de onda ideal (feixe azul) para excitar o Fluorocromo utilizado na
amostra. A luz é refletida pelo espelho dicroico, cuja função é transmitir (deixar passar)
comprimentos de ondas específicos e refletir outros.
Somente então o feixe azul atravessa a objetiva, sendo concentrado na região da amostra que
é iluminada naquele momento. Os anticorpos conjugados a Fluorocromos presentes na
amostra são excitados pelo feixe e emitem luz que possui comprimento de onda distinto do
feixe azul (feixe verde), que volta ao espelho dicroico, e é transmitida ao filtro de emissão. O
filtro de emissão seleciona o comprimento de onda específico e a imagem final pode ser
visualizada diretamente na ocular ou por câmeras específicas. Os filtros de emissão e
excitação, bem como o espelho dicroico, ficam no interior de um cubo, o chamado cubo de
fluorescência, localizado acima da objetiva (Figura 17).
Fonte: O autor.
Figura 17: Esquema simplificado do mecanismo de funcionamento do microscópio de
fluorescência.
Além disso, moléculas fluorescentes específicas podem ser injetadas inclusive em animais
vivos e culturas celulares viáveis, funcionando como rastreadores. Tais métodos são úteis para
estudar junções intercelulares, detectar marcadores de crescimento celular e rastrear a via de
fibras nervosas, por exemplo.
ATENÇÃO
A escolha do conjunto de filtros é extremamente importante, pois estes devem ser compatíveis
com o espectro de excitação e emissão do Fluorocromo utilizado.
MICROSCOPIA CONFOCAL
Durante nosso percurso pelos tipos de microscopia de luz, vimos que, para observar uma
amostra biológica, é necessário que ela esteja bem delgada, permitindo a passagem da luz.
Além disso, essa amostra normalmente possui espessuras diferentes em variadas áreas, o que
resulta em imagens que estão no foco e fora dele. Amostras muito espessas criam uma
imagem borrada justamente por possuírem muitos planos fora de foco. Além disso, mesmo em
uma amostra delgada, a focalização da imagem ocorre em todos os planos ao mesmo tempo.
Assim, vamos sempre observar todas as nossas estruturas em um único plano, sem
conseguirmos juntar todos esses planos de foco para montar uma imagem tridimensional. E
não é novidade para ninguém que todos os organismos são tridimensionais. Então, como
resolver esse problema?
Fonte: Vshivkova/Shutterstock.
Cultura de fibroblastos humanos observada por microscopia confocal. O núcleo está em
vermelho, enquanto verde marca filamentos de actina e azul os filamentos de tubulina.
Para entender melhor como isso funciona, precisamos conversar um pouco sobre a
confocalidade.
O princípio da confocalidade é a base da microscopia confocal e foi descrito pela primeira vez
em 1955. No microscópio confocal, encontraremos duas barreiras físicas, com uma distância
entre si do tamanho de uma cabeça de alfinete (o chamado pinhole ).
O pinhole encontra-se no mesmo plano focal da amostra e impede a passagem de luz das
regiões que não estão no foco. Além disso, funciona como um divisor de feixes luminosos, que
vão incidir em diferentes planos da nossa amostra.
PINHOLE
O pinhole , que significa “cabeça de alfinete” é o espaço que os dois anteparos possuem
entre si. Os dois anteparos são a barreira física, o pinhole é a distância entre os dois
anteparos.
Fonte: O autor.
Figura 18: Representação esquemática dos anteparos físicos e do pinhole .
A maioria dos microscópios confocais utilizam lasers como fontes de iluminação. Após deixar a
fonte, o feixe luminoso é dividido pelo pinhole em outros feixes, que caminham até o espelho
dicroico. Lá, serão refletidos de diversas maneiras, por conta dos diferentes ângulos que
encontram esse espelho. Uma vez refletidos, os feixes incidem em diferentes pontos da
amostra marcada com Fluoróforos, assim como na microscopia de fluorescência.
Após esses feixes luminosos serem absorvidos pelas moléculas fluorescentes, são emitidos
outros raios em outros comprimentos de onda, que passam pelo espelho dicroico e são
captados por detectores especiais chamados de fotomultiplicadores.
A função dos fotomultiplicadores é captar os fótons emitidos e gerar sinais elétricos com
intensidade proporcional à quantidade de sinal captado. Perceba que apenas a fluorescência
emitida pelo plano que está em foco será captada pelo detector, enquanto todos os outros
planos que não estão em foco são eliminados pelo pinhole .
Fonte: O autor.
Figura 19: Mecanismo simplificado do funcionamento do microscópio confocal.
ATENÇÃO
Por se tratar de uma iluminação a laser, que é uma luz contínua em forma de ponto, não
conseguimos formar uma imagem completa do campo. A imagem final, na verdade, é uma
montagem feita pelo computador a partir da aquisição de todos os pontos focais. Por esse
motivo, não conseguimos observar a imagem diretamente nas oculares do microscópio.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. VOCÊ É O RESPONSÁVEL POR UM GRANDE CENTRO DE
MICROSCOPIA MULTIUSUÁRIO E RECEBE DE UM ALUNO DE INICIAÇÃO
CIENTÍFICA UMA LÂMINA DE FÍGADO DE PACIENTE, MARCADO COM
DIFERENTES FLUORÓFOROS. ELE PEDE SUA AJUDA PARA OBSERVAR
AS ESTRUTURAS MARCADAS COM GRANDES DETALHES. PELAS
CONDIÇÕES DA AMOSTRA APRESENTADA, QUAL SERIA A
MICROSCOPIA QUE VOCÊ INDICARIA PARA ESSE USUÁRIO?
B) Microscopia confocal
D) Microscopia de fluorescência
B) Os filtros de excitação são lentes transparentes colocadas após as lentes objetivas de forma
a intensificar a emissão da imagem luminosa para as lentes objetivas, contribuindo, dessa
forma, com a ampliação final da imagem adquirida.
C) A escolha dos filtros a partir dos Fluoróforos utilizados nas amostras não interfere na
visualização da imagem, já que todos os Fluoróforos podem ser excitados por qualquer
comprimento de onda.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Durante nossa jornada, vimos os princípios e as características principais da luz, que são a
base para o estudo da microscopia. Conversamos sobre os principais componentes do
microscópio e suas funções, a importância das objetivas e a diferença entre ampliação e
resolução. Também aprendemos a fazer o correto ajuste de iluminação para obter uma imagem
com qualidade. Para encerrar, vimos as principais modalidades de observação em microscopia
de luz, suas diferenças e múltiplas aplicações nas ciências biomédicas.
AVALIAÇÃO DO TEMA:
REFERÊNCIAS
CORRÊA, J. R. et al ., Microscopia Confocal Básica. In : Introdução à Microscopia Confocal
de Varredura a Laser. Universidade de Brasília, 2015.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2017.
EXPLORE+
Para aprofundar os seus conhecimentos no assunto estudado neste tema, recomendamos os
seguintes materiais:
No canal Escola CVI, no Youtube, há uma série completa de vídeos sobre os diferentes
tipos de microscopia de luz. Pesquise por Conceitos gerais de microscopia .
No canal CePOF & INCT Óptica Básica e Aplicada, no Youtube, busque o vídeo História
da Microscopia óptica e conheça mais sobre a história dos microscópios.
Para ler um pouco mais sobre as diferentes modalidades de microscopia de luz, visite o
site da Kasvi e leia a reportagem Microscópio – conheça as diversas técnicas de
microscopia .
CONTEUDISTA
Gabriela Cardoso Caldas
CURRÍCULO LATTES