SINOPSE Microscopia de luz

* Assunto: Microscopia.
* Pré-requisito: Noções básicas de microscopia de luz. Parte 2

* Objetivo: Diferenciar as várias técnicas de microscopia

Com a ajuda do microscópio não há nada
de luz.
tão pequeno que possa escapar às nossas
investigações; portanto há um novo e visível mundo
* Bibliografia: descoberto a ser entendido (Hookie, 1664).

1 – SOUZA. Microscopia Óptica: Fundamentos e aplicações

às ciências biomédicas.
Paulo Roberto Queiroz
2 - SOUZA. Técnicas de microscopia eletrônica aplicadas às
Dr. Biologia Animal
ciências biológicas.
3 – JUNQUEIRA. Biologia celular e molecular.

MICROSCOPIA DE LUZ
O microscópio de luz é
Microscópios são aparelhos compostos pela associação de assim chamado devido sua
lentes de vidro para produzir uma imagem aumentada e detalhada fonte luminosa que é uma luz
de objetos, células, tecidos e órgãos que o olho humano branca oriunda de um filamento
desarmado não seria capaz de observar maiores detalhamentos de tungstênio (Melo, 2002).
(Taboga, 2001).

O conjunto de lentes é formado pelas objetivas e oculares. 1 - Microscopia de campo claro

A objetiva está mais próxima do objeto, capta a luz
filtrada pela condensadora e projeta uma imagem real, invertida e
aumentada da estrutura. A lente ocular, presta-se a aumentar a
imagem projetada pela objetiva, para ser captada pelo olho do
observador (Parreira, 2005).
O microscópio de campo claro é o microscópio de luz mais
comum (Melo, 2002).
O campo de visão aparece iluminado e os objetos que estão
sendo observados apresentam-se mais escuros (Reis, 2003).

1
 Vantagens:
Weiss et al. (1991) apresentam algumas vantagens:
- menor toxicidade por necessitar de menores
concentrações de corantes;
- menor toxicidade por necessitar de menores
- baixo contraste, devido ao uso de baixas concentrações
concentrações de corantes;
de cromóforos naturais ou corantes vitais (pode ser grandemente
aumentado);
- baixo contraste, devido ao uso de baixas concentrações
- observações feitas no comprimento de onda de máxima
de cromóforos naturais ou corantes vitais (pode ser grandemente
absorção aumentam o contraste.
aumentado);

Desvantagens:
- observações feitas no comprimento de onda de máxima apresenta algumas limitações como objetos de fase exibem
absorção aumentam o contraste. mínimo contraste em foco e mostra contraste oposto por cima e
abaixo do foco.

2 - Microscopia de campo escuro 2 - Microscopia de campo escuro

Baseia-se no princípio de que a luz é dispersa pela

superfície dos materiais que possuem diferentes índices de Tal efeito é obtido pela utilização de um tipo especial de

refração. condensador que ilumina o objeto obliquamente (Reis, 2003).

A luz dispersa entra na objetiva e o objeto aparece

A luz atinge o espécime a ser analisado e somente os
iluminado e brilhante contra um fundo escuro.
feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema, isto
é, objetivas e oculares, formando a imagem (Taboga, 2001).

Qual é a função da técnica de campo escuro?

* Produz um contraste negativo

- Bloqueia os raios não desviados centrais, permitindo apenas a

passagem de raios desviados em um ângulo suficiente para
serem captados pela objetiva;

- Os eventos de refração e reflexão são responsáveis pela

produção de raios desviados;
Acessórios obrigatórios: anel de

- A amostra fica clara contra um fundo escuro; campo escuro para o condensador;

- Cria uma aparência tridimensional da amostra; Não há objetivas especiais para esta técnica.

A resolução é a mesma do campo claro. Só entra luz na objetiva se houver material com índice de
refração maior que o da água.

2
Finalidades:
3 - Microscopia de contraste de fase

Objetos muito pequenos, cuja visualização é difícil sobre Esse tipo de microscopia baseia-se nos princípios de
um fundo claro; difração da luz, isto é, o caminho do feixe luminoso, na formação
da imagem, sofre um atraso óptico, permitindo assim que se possa
É um tipo de microscopia utilizada na observação de
observar materiais biológicos sem a coloração (Taboga, 2001).
microrganismos não corados, suspensos em líquidos, preparações a
fresco e em gota pendente (Reis, 2003), plâncton, bactérias,
grãos de pólen (Taboga, 2001).

Pode permitir a detecção de estruturas muito menores que

o poder de resolução do microscópio (0.02 mm), mas isto NÃO
significa que a técnica aumenta a resolução.

APLICAÇÕES: APLICAÇÕES:

- Estudar células vivas e não coradas (Melo, 2002);
- Particularmente útil para o estudo da mitose em células
cultivadas in vitro (Reis, 2003);
Então, grande parte dos detalhes de células vivas não são
detectados no microscópio de campo luminoso devido ao fato das
estruturas celulares serem transparentes e incolores, não
apresentando contraste suficiente.

- Exames rápidos de culturas de células, sangue, bactérias,

Contudo, o microscópio de contraste de fase tem um
algas, protozoários de ambientes aquáticos, conteúdo estomacal
sistema óptico especial que torna possível a distinção de materiais
de animais;
biológicos que diferem ligeiramente no que se refere aos seus

- Análise de materiais cerâmicos, têxteis e minerais índices de refração.

(Taboga, 2001).

PRINCÍPIO: Componentes do sistema de fase

1) Amplitude: alteram a intensidade da luz transmitida.
A luz que passa através de materiais com densidades Amostras transparentes coradas causam o mesmo
efeito.
ligeiramente diferentes é refratada ou desviada do seu trajeto
2) Fase: não absorvem luz, mas causam mudança de fase nos
original. comprimentos de onda que a atravessam.

Variações mínimas de fase, devidas às diferenças de índice

de refração dentro do objeto, são ampliadas e transformadas em
mudanças de amplitude (intensidade) as quais são visualizadas
como diferenças de contraste na imagem (Reis, 2003).

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 Tipos possíveis de contraste Efeito do contraste de fase
1) Contraste de fase positivo Contraste positivo
- Acelera os raios não desviados em ¼ de λ, elevando a Parte central
do anel mais
diferença de fase total para ½ de λ; fina que a
periferia
- a amostra fica escura, circundada por halo claro,
sobre um fundo mais claro (menos claro que o halo).
Contraste negativo
2) Contraste de fase negativo
Parte central
do anel mais
- Retarda os raios não desviados em ¼ de λ, elevando a fina que a
periferia
diferença de fase total para ½ de λ;

- a amostra fica clara, circundada por halo escuro,

sobre um fundo mais escuro (menos escuro que o halo).

O microscópio de contraste de fase apresenta sistemas de Um anel na lente condensadora e outro anel nas objetivas.
anéis metálicos postos no caminho da luz. Uma singular particularidade é que as objetivas de fase
apresentam a designação “Ph”, oriunda da palavras phase,
diferenciando-a das demais.

4 - Microscopia de contraste interferencial

Esses anéis, após centralizados, promovem o retardo
óptico, permitindo assim a visualização do espécime sem coloração A microscopia interferencial mais conhecida é a chamada
(Taboga, 2001). de microscopia de Nomarski.

Esse tipo de contraste interferencial trabalha com a

defasagem dos comprimentos de ondas.

4
 4 - Microscopia de contraste interferencial

Assim, a defasagem gera uma deformação na imagem,

permitindo o contraste interferencial, aumentando a superfície Esse tipo de microscopia utiliza-
do material analisado. se de prismas ópticos posicionados na
Permite o aumento do relevo das superfícies do objeto passagem da luz.
analisado.
Esses prismas modificam as fases

Aplicações: luminosas que contrastarão com o meio

em que se encontra o material a ser
- Observação de materiais biológicos sem coloração; observado.
- Monitoramento de culturas celulares;
- Estudo de morfologia, taxonomia de pequenas larvas e
ácaros e outros ectoparasitas (Taboga, 2001).

Tem dois prismas ópticos colocados no caminho da luz, 5 - Microscopia de fluorescência

para modificar a fase da onda luminosa, que contrasta com o meio
A microscopia de fluorescência é, provavelmente, a mais
onde está o material a ser analisado.
versátil e poderosa técnica para localizar proteínas dentro da
Esse microscópio requer uma célula pela microscopia de luz (Lodish et al., 2003).
construção específica, apesar de não
Fluorescência é a propriedade de algumas substâncias
utilizar lentes objetivas especiais, ele
(após excitadas com radiação de baixo comprimento de onda)
necessita de um revólver com ranhuras
emitirem radiação de maior comprimento de onda.
para alojar os prismas de
interferência, então as cores de
Algumas substâncias absorvem a energia da radiação
interferência promoverão a
ultravioleta emitindo depois radiação dentro do espectro de luz
visualização da imagem (Taboga, 2001).
visível.

Aplicações: É com os recursos desta técnica que se evidenciam, por

exemplo, os antígenos quando associados a anticorpos acoplados a
Microrganismos corados por um corante fluorescente
moléculas fluorescentes, e quantifica-se pelo processo de
aparecem como objetos luminosos quando observados com luz
ultravioleta. fluorometria os objetos de estudo da citoquímica normal e
patológica (Taboga, 2001).

Toxoplasma gondii observado mediante microscopia de fluorescência.

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 FLUORÓFORO OU FLUOROCROMO
Na microscopia de fluorescência pode-se detectar
compostos naturalmente fluorescentes, como a clorofila, lignina de É um componente de uma molécula que faz com que esta seja

paredes celulares, elastina e colágeno (Taboga, 2001). fluorescente.

É um grupo funcional da molécula que absorverá energia de um

comprimento de onda específico e posteriormente a emitirá em outro
determinado comprimento de onda maior (ou seja, com menor energia).

A quantidade de energia emitida e seu comprimento de onda dependem

tanto do próprio fluorocromo como do ambiente químico no qual está

(como o pH, por exemplo).

Os fluorocromos, quando conjugados com anticorpos, tornam

possível a identificação de células individuais que reagem com o

anticorpo (aplicação designada de imunofluorescência) (Reis, 2003).

Os fluorocromos podem se combinar com estruturas celulares,

tornando-as fluorescentes, tornando-as passíveis de identificação e

localização, como proteínas ou estruturas celulares (Melo, 2002).

O microscópio de fluorescência utiliza um sistema óptico Os filtros de excitação localizam-se logo após a saída

que interage pouco com a luz. de luz antes do condensador, selecionando o comprimento de
onda desejado.
Utiliza-se uma luz de
Já, os filtros de
mercúrio de alta pressão, cujos
barragem localizam-se entre
picos variam entre 312 e 579 nm.
a objetiva e a ocular, após o
objeto, deixando passar
Nessa microscopia também
somente a luz fluorescente,
há filtros especiais chamados de
então o material fluoresce
filtros de excitação e filtros de
contra um fundo escuro
barragem (Taboga, 2001).
(Taboga, 2001) .

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Desvio de Stokes
O desvio de Stokes corresponde à diferença (de comprimento de
onda ou unidades de frequência) entre as posições no espectro dos
pontos máximos das bandas de absorção e emissão de fluorescência para
a mesma transição electrônica.
Fenômenos de fading, quenching, photobleaching
Existem um largo espectro de condições que regularmente surgem e
afetam as radiações da emissão de fluorescência e vão reduzir a sua intensidade.
O termo geral para a redução da intensidade de emissão de
fluorescência é fading (desvanecimento), sendo este subdividido em fenômenos,
tais como, o quenching (extinção) e photobleaching (lixiviamento/branquemento).
PHOTOBLEACHING
Uma técnica relacionada, denominada perda de fluorescência em
photobleaching (FLIP – fluorescence loss in photobleaching) é utilizada para
monitorar o decréscimo de fluorescência em uma determinada região adjacente
à área branqueada.
Geralmente, a emissão de fluorescência vai ocorrer a um
comprimento de onda superior ao de absorção da mesma. Todavia, caso
o fenômeno contrário se verifique é denominado por desvio anti-Stokes.
À medida que o desvio de Stokes aumenta, torna-se mais fácil
separar luz de excitação da luz de emissão pelo uso de combinações dos
filtros.
PHOTOBLEACHING
O photobleaching corresponde à decomposição irreversível das
moléculas fluorescentes no seu estado excitado devido à interação destas
moléculas com oxigênio molecular antes de emitirem energia.
A ocorrência do photobleaching é explorada em uma técnica conhecida
por recuperação de fluorescência após photobleaching (FRAP – fluorescence
recovery after photobleaching).
O método baseia-se no branqueamento de uma região bem definida da
amostra devido a uma intensa explosão de luz laser, acompanhada por uma
subsequente observação das taxas e padrões da recuperação de fluorescência
nas áreas branqueadas.
O processo de relaxamento após o estado excitatório, no
quenching, resulta em uma redução da intensidade de fluorescência por
uma variedade de mecanismos que envolvem perda de energia não
radioativa e, frequentemente, ocorre como resultados de agentes
oxidantes, presença de sais, metais pesados ou compostos de
halogênio.
Em alguns casos, o quenching resulta da transmissão de energia
para outra molécula (aceptor) fisicamente próxima do fluoróforo
excitado (doador), sendo este fenômeno conhecido por ressonância de
energia transferida em fluorescência (FRET – fluorescence resonance
energy transfer).
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 6 - Microscopia de varredura confocal

A microscopia de varredura confocal representa um dos

mais importantes avanços da microscopia de luz já desenvolvida,
principalmente, porque é uma técnica capaz de visualizar em
profundidade células e tecidos, tanto vivos quanto fixados
(Fellers e Davidson, 2005).

O microscópio de varredura confocal é indicado para

estudos de materiais espessos, sem coloração prévia, vivos ou
O espécime é “escaneado”
pré-fixados.
com uma série de muitos
estreitos campos de visão, as
Essa microscopia permite o detalhamento de estruturas
imagens destes campos são
subcelulares que não apresentam limite de resolução compatível
recuperadas individualmente, e
ao da microscopia de luz fluorescente convencional, como
depois de estocadas, a imagem
microtúbulos, elementos fibrilares do citoesqueleto e elementos
completa é construída como um
finos da matriz celular (Taboga, 2001).
mosaico de partes combinadas
(Lacey, 1991).
Permite estudos de FRET, FLIP e FRAP.

Nesse microscópio, a imagem pode ser obtida de planos

focais específicos ou cortes ópticos.

Os cortes ópticos são transferidos para um computador e

são reconstruídos tridimensionalmente de forma a obter uma
imagem no total.

Logo, o microscópio tradicional trabalha com imagem

analógica e o confocal a laser trabalha com imagem digital
(Taboga, 2001).

Invasão bacteriana observada por microscópio confocal. (A) B. fragilis marcado

com soro anti-B fragilis (vermelho); (B) membranas marcadas com DiOC6(3) (verde); (C) a
sobreposição das imagens mostrando a invasão bacteriana em células HEp-2 (laranja-
vermelho). As imagens foram capturadas e analisadas pelo microscópio confocal laser
(Aumento: 1.000X). – Escala = 10 µm.

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 As imagens são
digitalizadas em 8 bits
(escala de cinza) em 3
canais R G B e a
sobreposição com
sistema de
pseudocores permite
identificar a
localização.

Funcionamento A luz do laser é diferente da luz normal, possuindo as

seguintes características:
O microscópio de varredura confocal utiliza como fonte de luz o
laser, sendo seu funcionamento complexo. * Monocromática: possui um comprimento de onda
Seu sistema óptico é o mesmo da específico de luz, o que vai resultar numa cor específica;
de fluorescência tradicional, com exceção
de que a iluminação se dá somente em * Coerente ou "organizada": cada fóton move-se
pequenos pontos iluminados pelo laser. juntamente com restantes. Todos os fótons possuem frentes
iniciadas simultaneamente;
Acima da objetiva existe um
orifício chamado pinhole ou íris que * Direcionada: Possui um feixe estreito e concentrado,
elimina a luz proveniente de objetos que contrariamente a outras fontes de luz que produzem dispersão;
estejam fora do plano focal (Albert et al.,
1994). * Intensa.

Graças à sensibilidade dos detectores fotoelétricos e o
controle eletrônico da intensidade dos sinais, imagens pouco
evidentes na microscopia de fluorescência são observadas com
mais nitidez na microscopia confocal (Taboga, 2001).
O sistema óptico usado neste tipo de microscópio é o
Microscopia Multifoton
Esta técnica é uma poderosa ferramenta de investigação, que
combina microscopia confocal com fluorescência multifotônica de longo
comprimento de onda, permitindo a obtenção de imagens tridimensionais
de alta resolução, de alvos marcados com fluorocromos muito
específicos.

mesmo que é aplicado nos microscópios de fluorescência.

No entanto, nestes últimos, o campo é todo iluminado,

enquanto que no microscópio confocal focaliza somente um ponto
em determinada profundidade no espécimen.

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 Assim sendo, é possível conjugar vários lasers que emitem em
Deste modo, a técnica consiste na marcação da amostra
comprimentos de onda inferiores, mas cujo somatório permite a
biológica em estudo, com uma ou mais sondas fluorescentes antes de ser
excitação de um elétron.
examinada no microscópio

Deste modo, apenas são excitados os elétrons que se encontram

é extremamente importante e necessário pois os
no ponto de intersecção dos lasers e que são específicos para esse
tecidos/estruturas tissulares não possuem contraste suficiente para
comprimento de onda (somatório dos comprimentos de onda de cada
serem visualizadas.
laser).

Uma única fonte de luz (laser) possui energia suficiente para

excitar um elétron nas sondas fluorescentes, caso tenha um
comprimento de onda adequado.

Esse microscópio apresenta dois prismas, ou filtros,

Os filtros polarizadores promovem a seleção de apenas um
chamados de polarizador e analisador.
plano de direção de vibração de ondas luminosas, conhecido por
plano da luz polarizada (PPL).
Esses filtros se
posicionam entre a fonte
de luz e o condensador
(filtro polarizador) e entre
a objetiva e a ocular (filtro
analisador).

Os materiais biológicos mais estudados são:

Sob o efeito do PPL, os componentes macromoleculares
birrefringentes (anisotrópicos) apresentam brilho colorido ou não,
promovendo um realce destes materiais em detrimento a outros
não birrefringentes (isotrópicos), que se distinguem em fundo
escuro (Taboga, 2001).
- células musculares estriadas, espermatozóides, paredes
celulares, amido, colágenos e DNA (Taboga, 2001).
- em estudos com o colágeno, pode-se aumentar sua
birrefringência utilizando-se corantes como, Xylidine Ponceaus ou
Picrosirius.

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 INMETRO – Cargo 34 - Com relação à microscopia de fluorescência, assinale a
opção correta.
E A Fundamenta-se na captação exclusiva de emissões luminosas de comprimento de
onda definido originados de compostos autofluorescentes presentes nas amostras
analisadas.
E B Utiliza raios infravermelhos como fonte luminosa o que permite a emissão de
fluorescência em todos os comprimentos de onda dentro do espectro da luz visível.
C C Fundamenta-se na captação diferencial de determinados comprimentos de ondas
luminosas por meio da combinação de filtros e lentes. Esses comprimentos de ondas
luminosas dentro do espectro da luz visível são interpretados pelo olho humano
como cores.
E D Nesse tipo de microscopia, o feixe luminoso branco passa por um prisma onde a
luz é decomposta em todos os seus comprimentos de onda O reagrupamento dos
diferentes comprimentos provoca o fenômeno da fluorescência.
E E Utiliza anticorpos que, por serem moléculas emissoras luz de alta energia, geram
fluorescência em todos os comprimentos de onda luminosa dentro do espectro da
luz visível, o que permite a identificação da estrutura a qual o anticorpo está
associado.

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