3/3/2010

Universidade Federal de Goiás

Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Morfologia

Disciplina: Biologia Celular

MÉTODOS DE ESTUDO DAS CÉLULAS

Profa. Mara Rubia Marques

2010

MICROSCOPIA

Microscópio é um instrumento que produz imagens

ampliadas de objetos de tal ordem pequenos que não
podem ser vistos a olho nu.

Tipos de microscopia:

 Microscopia de Luz - o espécime é atravessado por feixes de luz.

 Microscopia Eletrônica - o espécime é atravessado por elétrons.

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PODER DE RESOLUÇÃO

Menor distância entre duas partículas para que sejam vistas

como unidades separadas.

ML MET

0,2 µm 3 nm

PODER DE RESOLUÇÃO

1 cm = 10-2 m
1 mm = 10-3 m
1µm = 10-6 m
1 nm = 10-9 m
1 Å = 10-10 m

Célula animal típica: 10 a 20 µm

(1/5 da menor partícula visível a olho nu).

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MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
• Varredura • Transmissão

MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA

É uma técnica que permite a
visualização das superfícies de
espécimes não seccionados. A amostra
é fixada, dessecada e revestida com a
camada fina de um metal pesado. A
micrografia obtida tem um aspecto
tridimensional.

http://universoemequilibrio.blogspot.com/2009_02_01_archive.html

http://www.ufmt.br/bionet/conteudos/01.09.04/varredura.htm

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MICROSCÓPIO
ELETRÔNICO
DE TRANSMISSÃO

MICROSCOPIA
DE
LUZ

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MICROSCÓPIO DE LUZ MODERNO

Várias lentes na objetiva e na ocular

1 – Condensadora
2 – Objetiva
3 – Ocular
4 – Fonte luminosa
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5 – Platina
6 – Charriot
7 – Macro e micromanipuladores
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MODALIDADES DE OBSERVAÇÃO NA MICROSCOPIA DE LUZ

1. Campo claro
2. Campo escuro
3. Contraste de fase
4. Contraste interferencial
5. Polarização
6. Fluorescência
7. Microscópio invertido
8. Microscópio estereoscópico (lupa)
9. Confocal a laser

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Campo claro Campo Escuro

A luz atravessa o material analisado.

Um sistema especial de condensador
faz com que a luz fique de tal forma
inclinada que não atravessa o
material. Apenas os feixes desviados
pelo objeto são observados.

Contraste de fase Contraste Interdiferencial

(Normarski)

Anéis na lente condensadora e Prismas ópticos no caminho da luz

objetivas promovem retardo óptico modificam a fase de onda luminosa.
no caminho do feixe luminoso.

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Polarização

Côndilo mandibular e disco articular. Corante: Picrossírus

Dois filtros (polarizador e analisador) que selecionam apenas um plano de

direção de vibração da luz: plano de luz polarizada (PPL).

Fluorescência
As substâncias absorvem a luz em
um comprimento de onda e
emitem luz com comprimentos
maiores.
•Fonte luminosa: luz de mercúrio
•Filtros: De excitação / barragem.

Componentes autofluorescentes:
colageno, lignina, clorofila,
elastina.
Fluorocromos – permitem
localização de estruturas.

Células cancerosas coradas com Orange de

acridina.
RNA – vermelho
DNA - amarelo

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Confocal a laser

Cortesia de M. F. Santos

Microscópio invertido

Sans e Quevedo, 2007

O microscópio invertido tem o sistema de iluminação acima do estágio e o sistema de lentes

embaixo. Permitem a visualização através de espécimes espessos, como placas de cultivo de
células, pela proximidade da lente ao fundo da placa.

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Microscópio estereoscópico

Observação de objetos opacos por onde a luz

não passa, tais como: cristais, fósseis e moedas.

TIPOS DE PREPARO HISTOLÓGICO

Preparos a fresco (temporário) – vantagens / desvantagens

Preparos permanentes – vantagens / desvantagens.

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TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE ESTUDO

1. COLETA DO MATERIAL
2. FIXAÇÃO
3. DESIDRATAÇÃO
4. DIAFANIZAÇÃO
5. INCLUSÃO/EMBEBIÇÃO
6. MICROTOMIA
7. COLORAÇÃO

TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO DE ESTUDO

http://www.icb.ufmg.br/mor/biocelch/metodos_estudo/Figura%202.jpg

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COLETA

Tipos de coleta: Biópsia cirúrgica

Biópsia endoscópica
Biópsia por agulha
Cirurgias amplas
Necrópsia

Tamanho do material: A amostra deve ser fragmentada a fim de permitir

a penetração do fixador por toda sua extensão. De 0,5 a 1 cm.

FIXAÇÃO

A fim de conservar as células ou tecidos no estado em que se

encontravam em vida. O volume do fixador deve ser no mínimo 10X o
volume do material fixado.

Qualidades dos fixadores:

1. Alto poder de penetração
2. Manter as características do tecido e conservar os detalhes estruturais
da célula
3. Favorecer a observação das estruturas
4. Conservar ou aumentar a afinidade dos tecidos pelos corantes.

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FIXAÇÃO

• Formol 10% – fixador mais comum na MO.

Tempo de fixação: conforme tamanho e natureza da peça. Em geral de
12 a 24 horas.

PROCESSAMENTO
Inclusão da amostra em um material que permita a realização de cortes
finos desta amostra. Geralmente em Parafina ou seus derivados.

- Desidratação ( Álcool)
- Diafanização (Xilol)
- Inclusão (parafina líquida a 58-600C)

ÁLCOOL XILOL PARAFINA

DESIDRATAÇÃO DIAFANIZAÇÃO INCLUSÃO

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MICROTOMIA

 Micrótomo rotativo tipo Minot

 Espessura de 3 a 7 µm

CONFECÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOS

Distensão do
corte em
água fria

Distensão do
corte em água
quente ±400 C

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PROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃO

1. DESPARAFINIZAÇÃO: Retirada da parafina do material
•Xilol I ... 20 min
• Xilol II ... 20 min
• Xilol III ... 20min
2. HIDRATAÇÃO
• Álcool a 100% I ... 1 min
• Álcool a 100% II ... 1 min
• Álcool a 100% III ... 1 min
• Álcool a 95% ... 1 min
• Álcool a 70% ... 1 min
• Álcool a 50% ... 1 min
• Dois banhos em água destilada de 05 min cada.

PROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃO

3. COLORAÇÃO

Hematoxilina e eosina (HE) é o corante de

rotina

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PROCESSAMENTO PARA COLORAÇÃO

4. MONTAGEM DA LÂMINA
• Álcool a 95% ... 1 min
• Álcool a 100% I ... 1 min
• Álcool a 100% II ... 1 min
• Álcool a 100% III ... 1 min
• Xilol I ... 1 min
• Xilol II ... 1 min
• Xilol III ... 1 min – iniciar a montagem.

• Proteção por Lamínulas de vidro

• Meios de montagem: Bálsamo do canadá, Permount, Entelan

CULTURA DE CÉLULAS

Forma de estudo das células mantendo-as isoladas, fora do

organismo de origem, sem perder suas características naturais.

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CULTURA DE CÉLULAS

TIPOS DE CULTIVO CELULAR

Cultura primária – tecidos obtidos diretamente do animal e tratados com
enzimas (tripsina) que dissocia as células que serão cultivadas em placas com
meio de cultivo especial.

Cultura secundária – obtida de uma cultura primária tratada enzimaticamente e

cultivada em outra placa.

Linhagem celular – As células podem proliferar indefinidamente devido às

características cancerosas. Linhagens amplamente usadas:

HeLa – obtida a partir de carcinoma humano

L – embrião de rato
3T3 - embrião de rato
BHK – rim de Hamster reçém nascido
CHO – ovário de Hamster adulto

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CITOQUÍMICA
Usada para identificar, in situ, diferentes compostos químicos das células.
Reações químicas ajudam a mostrar estruturas intracelulares com colorações
específicas. Podem ser usadas amostras frescas.

Colorações mais usadas:

Azul da prússia – identificação de ferro (ferritina/hemossiderina)

Peroxidase – detecção da enzima mieloperoxidase distinção entre células de

origem mielóide e linfóide.

Sudan Black B – revelação de lipídios

Ácido Reativo de Schiff (PAS) – evidenciação de carboidratos

Fosfatase alcalina – neutrófilos maduros, osso, fígado, rins, placenta. Ajuda a

determinar a atividade da célula.

Células tumorais (*Astrócitos).

Hemossiderina evidenciada por Azul da Prússia

(Pearls)
http://anatpat.unicamp.br/nptganglioglioma7a.html

Células sanguíneas
Peroxidase evidenciada em neutrófilos

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Leucemia crônica
Lipídios evidenciados por Sudan Black

Glândulas intestinais
Carbohidratos evidenciados por PAS

Músculo esquelético
Evidenciação de mATPase

Osso
Evidenciação de ions cálcio

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Raiz de cebola
Evidenciação DNA por Feulgen
http://fotos.sapo.pt/tw3PfHMLey2fi8BjuDAT

Peciolo de Geranium dissectum

Fluorescência natural da clorofila
www.milcores.pt

IMUNOCITOQUÍMICA
Uso de anticorpos acoplados a marcadores
visíveis ao microscópio.
• HIQ direta
• HIQ indireta

Desmina

Receptor de laminina

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FRACIONAMENTO
CELULAR E
MOLECULAR

Frações:

1. Nuclear – núcleos e citoesqueleto

2. Mitocondrial – mitocôndrias, peroxissomos, lisossomos
3. Microssômica – RE, CG, membranas
4. Solúvel – ribossomos, macromoléculas, vírus
(ultracentrífuga analítica)

ULTRACENTRIFUGAÇÃO ANALÍTICA

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ELETROFORESE

Separação de moléculas por diferença

de potencial.

Gel de Agarose
Gel de Poliacrilamida

Visualização com brometo de etídio.

CROMATOGRAFIA

Método físico-químico de separação de proteínas.

Baseia-se na migração diferencial dos componentes de uma mistura entre uma
fase fixa (papel filtro, resinas carregadas, líquido depositado num sólido inerte)
e outra móvel (solvente).

Maior quantidade de proteínas

Menor pureza

Tipos:
Cromatografia de filtração por gel
Cromatografia de intercâmbio iônico
Cromatografia de afinidade.

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