TEMA: MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA

CELULAR E MOLECULAR
MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR E
MOLECULAR
• Os primeiros estudos da célula foram iniciados no
séc. XVII com a utilização de microscópios
rudimentares de luz , idealizados por Robert Hooke
(1635-1703), que foram utilizados para observar as
primeiras células vegetais.

• O aperfeiçoamento dos sistemas ópticos concorreu

para o melhoramento da resolução dos microscópios
e para o desenvolvimento dos diversos tipos de
microscópios com maior definição.
MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR E
MOLECULAR
• Actualmente, os microscópios ópticos possuem
características especificas, que lhes permitem
visualizar os mais minuciosos aspectos das
particularidades das células.
• O aparecimento dos microscópios electrónicos
(TEM) e de varrimento (Scanning) com poderes de
resolução muito elevados e com sistemas de registo
de imagens, inicialmente fotográficos e
posteriormente digitais, permitiu um avanço no
conhecimento das células e das suas estruturas,
bem como a identificação de outras que a
microscopia de luz até então, não tinha conseguido
visualizar.
 MICROSCOPIA
O Desenvolvimento de técnicas de preparação laboratorial
para a visualização dos materiais biológicos permitiu o
aparecimento de diversos tipos de microscopia:

• Microscopia óptica (200 nm)

– Campo claro
– Fluorescente
– Avançada:
• Microscopia Confocal
• Microscopia de contraste fases, etc.
• Microscopia electrónica (1 nm)
– Transmissão (TEM)
– Varrimento ou Scanning (SEM)
 TIPOS DE MICROSCÓPIOS

• Microscópio electrónico de
• Microscópio óptico composto transmissão
• Microscópio de luz ultravioleta • Microscópio electrónico de
• Microscópio de fluorescência varrido
• Microscópio petrográfico • Microscópio de iões em
• Microscópio de campo escuro campo
• Microscópio de contraste de fases • Microscópio de sonda
• Microscópio de luz polarizada • Microscópio de efeito túnel
• Microscópio Confocal • Microscópio de força atómica
• Microscópio electrónico • Microscópio virtual
• Estéreo Microscópio
UNIDADES DE MEDIDA EM CITOLOGIA

Servem para medir as células

• Comprimento
– μm (micra o micrómetro) = 10 -3 mm
• (milésima parte do milímetro)
– nm (nanómetro) = 10 -6 mm
• (milésima parte do micrómetro)
– Ä (Ängstrom) = 10 -7 mm
• (décima da milésima parte do
micrómetro)
UNIDADES DE MEDIDA EM CITOLOGIA
Servem para pesar as células
• Massa:
– mg (miligrama) = 10 -3 g
– μg (micrograma) = 10 -6 g
– ng (nanograma) = 10 -9 g
– pg (picograma) = 10 -12 g
– Da (dalton) = peso de um átomo de hidrogénio
• Ex: H2O = 18 Da
– kDa (quilodalton) = 103 Da
• Ex: Hemoglobina = 64,5 kDa ou 64 500 Da
O MICROSCÓPIO ÓPTICO
MICROSCOPIA DE CAMPO CLARO
A luz passa através da amostra fazendo com que a área observada seja
bem iluminada. O feixe de luz passa através da amostra e é captado pela
objectiva. O microscópio usado pela maioria dos estudantes e
pesquisadores é o microscópio de campo claro.

É usada para o exame de rotina de laminas histológicas, visualização de

tecido de células, microrganismos, etc. nos laboratórios de analises clínicas
e pesquisa.

MICROSCOPIA DE CAMPO ESCURO

Alguns raios luminosos incidem na amostra e são captados pela lente

objectiva gerando figuras luminosas num campo escuro.

É indicada para amostras com pouco contraste. Na pratica clínica o

microscópio de campo escuro serve para examinar a existência de cristais
nas amostras de urina, como o acido úrico e oxalato e identificar bactérias
como Treponema pallidum (Sífilis).
 Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Células da mucosa bucal

Diferenças de
Sem coloração índices de
refracção

Cores de
Com coloração interferência

Campo
Com coloração
escuro
fluorescente
Microscopia de campo claro e sistema analisador
de imagens

• Sistema Analisador de
Imagens - medidas manuais e
automáticas, incluindo filtros de
estruturas por forma, tamanho e
cor.
Preparação do espécime para microscopia de
campo claro (cortes)

2001/2002
Prof. Doutor José Cabeda
MICRÓTOMO
Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro

http://www.esacademic.com/pictures/eswiki/50/250px-
Plagiomnium_affine_laminazellen.jpeg
Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro
Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro
Exemplo de algumas imagens obtidas com microscopia de campo claro
Aplicações da Microscopia
de Campo Escuro
É empregue para estudos de
pequenos materiais:
 Plâncton
 Bactérias
 Cristais

Microscopia de campo escuro

da bactéria Leptospira spp
 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

• Permite a localização de moléculas específicas na célula

• Os corantes fluorescentes promovem uma marcação brilhante

contra um fundo escuro

•O corante pode estar directa ou indirectamente relacionado com a

molécula alvo da célula

•Podem ser utilizadas em simultâneo vários pigmentos

fluorescentes

• As células podem estar fixadas ou vivas.

 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
• O microscópio de fluorescência usa a capacidade de algumas
moléculas em fluorescer sob luz ultravioleta visualizando
moléculas auto fluorescentes como a vitamina A.

• A excitação e a emissão de luz das moléculas fluorescentes

são reguladas por filtros para promover cor e contraste.

• É utilizada na deteção de antígenos ou anticorpos nos

procedimentos de coloração imunocitoquímicos.

• As moléculas fluorescentes também podem ser injectadas em

animais ou em células para serem usadas como rastreadores.
Tais métodos são usados para estudar as junções
intercelulares, rastrear fibras nervosas e detectar marcadores
de crescimento em tecidos mineralizados.
O MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA
TÉCNICAS AVANÇADAS DE MICROSCOPIA E
FERTILIZAÇÃO
• Num estudo publicado na Scientific Reports, investigadores da
Northwestern descobriram que quando o óvulo humano é activado por uma
enzima do espermatozoide, ocorre uma explosão de faíscas de zinco.
• O tamanho da erupção está directamente relacionada com a saúde do ovo
e a sua capacidade de se transformar num embrião viável.
• Para entender o mecanismo molecular da centelha de zinco os
investigadores podem recorrer a quatro abordagens físicas que resolvem
distribuições de zinco em células individuais:
– uma sonda química para imagens de fluorescência de células vivas
dinâmicas
– uma combinação de microscopia electrónica de transmissão com
espectroscopia de energia dispersiva,
– microscopia de fluorescência de raios -X
– tomografia elementar tridimensional para o mapeamento elementar de alta
resolução.
Espermatozoides humanos corados com
laranja de acridina.
Observação microscópica de fluorescência
para avaliar os danos do ADN.
Cabeças dos espermatozoides corados de
verde possuem ADN normal, enquanto que
a coloração laranja indica alteração do
ADN.
Células epiteliais
em cultura, com
coloração vermelha
para a queratina e
verde para o DNA.
Micrografias de células em divisão celular, tiradas com um
microscópio de fluorescência

Foram utilizados três

fluoróforos:
• DAPI (emite luz azul) para
marcar cromossomas
• GFP (proteína verde
fluorescente intracelular que
emite luz verde)
• rodamina (luz vermelha) para
marcar os microtúbulos. Cada
fluorocromo justifica a utilização
de filtros específicos,
dependendo do comprimento de
onda necessário para excitação
(indicado em cima e do lado
esquerdo) escala expressa em
nm.
MICROSCÓPIO CONFOCAL
MICROSCÓPIO CONFOCAL
 Microscopia óptica de objectos 3D
 Microscopia de varrimento Confocal
– Gera imagens 3D de células vivas
– Remove imagens fora de foco
 seccionamento óptico
– Pode se fazer observações no interior de espécimes
espessos (ovos, embriões, tecidos)
Microscópio Confocal de
Raios Laser Cianobactéria
filamentosa Microcoleus
encontradas em solos de
terras áridas em todo o
mundo
Aplicações da Microscopia Confocal a Laser

Células em prófase

Células em apoptose: condrócitos

Aplicações da Microscopia Confocal a Laser

Protozoário Macrófago
Aplicações da Microscopia Confocal a Laser

Divisão celular / Fuso mitótico

Grãos de Pólen
 MICROSCOPIA ÓPTICA AVANÇADA

• Permite a observação de células vivas transparentes

• Os desvios de fase induzidas pela luz através do espécime são utilizados
para gerar contraste.

– Contraste de fase (luz refractada e não refractada)

– Contraste de interferência diferencial (dois feixes de luz)
MICROSCOPIA DE CONTRASTE INTERFERENCIAL
MICROSCOPIA DE CONTRASTE INTERFERENCIAL

Os prismas modificam a fase da onda luminosa

Contraste com o meio em que se encontra o material a ser

analisado
Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial

Observação de materiais biológicos sem coloração:

1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices dos parasitas

(taxonomia)
2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material
biológico
3. Monitorização de culturas celulares

Algas

Escamas
APLICAÇÕES DA MICROSCOPIA DE CONTRASTE
INTERFERENCIAL

Cultura Celular: macrófago Ácaro

 MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO
O microscópio de polimerização é uma modificação simples do microscópio
óptico e possui
 2 Filtros ou Prismas:

1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o espécime

2º Analisador → Entre a objectiva e a ocular

Filtros:

Promovem a seleção de apenas um plano de direcção de vibração das

ondas luminosas. Plano da luz polarizada (PLP)

Observação:
Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de
vibração em todos os planos
 MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO

2º

1º
APLICAÇÕES DA MICROSCOPIA DE POLARIZAÇÃO

1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados

de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina

2. Análise de células que apresentem organização interna de

suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular
esquelética, espermatozoides (ordem molecular).

3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos

arranjos de macromoléculas: tecidos ósseos, cartilagens, etc

4. Análise de componentes cristalinos dos minerais

5. Outros: parede celular; amido.

 Aplicações da Microscopia de Polarização

Tecido ósseo

Grãos de Amido
Aplicações da Microscopia de Polarização
Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada

Tecido ósseo : sistema de Havers Tecido ósseo: osso esponjoso /

ou ósteon / fibras colágenas fibras colágenas