UNIFENAS

MEDICINA
BIOLOGIA CELULAR

Métodos
de
estudo
das
células
Profas Eliane Perlatto e Dani Freitas
 BIOLOGIA CELULAR

Profª: Daniela Almeida Freitas (Afonso), PhD

Bióloga – PUC-Minas
Pós-Graduação – UFMG/ENSAR
Genética e Biologia Molecular de Microrganismos
Genética e Embriologia Humana
Citologia e Histologia
Morfofuncional

Contato: daniela.freitas@unifenas.br e
daniafreitas111@gmail.com
Métodos de estudo: microscopia

Por que estudar

citologia/histologia?
Organismo

Sistemas

Órgãos

Tecidos

Células
Métodos de estudo: microscopia

• Células/tecidos: peças para a montagem do

organismo

• Anomalias ou problemas de saúde: para

entendê-los é preciso conhecer o organismo

• Isso significa que precisamos compreender

cito/histo/fisiologia
Métodos de estudo: microscopia

Nosso principal objeto de estudo:

Diana Vilas Boas

100m
Métodos de estudo: microscopia

❖ O estudo da citologia e da histologia

depende da utilização da microscopia.

❖ Para se conhecer a “anatomia

microscópica” das células, tecidos e
órgãos, é necessário se fazer o uso do
microscópio.
 Microscopia

• Óptica, eletrônica, contraste de

fase, confocal
Métodos de estudo: microscopia

Microscópio óptico
composto com uma
única lente objetiva

Microscópio óptico
simples: “lupa”
 Microscopia óptica
(campo claro)
• Tecidos fixados e
corados

• Utilização de corantes
(diversos tipos): mais
comum HE

• Microscópio possui um
arranjo específico de
lentes para ampliar a
100m

imagem do tecido..
 Microscopia óptica
(campo claro)
Feixe de luz:

• Atravessa o tecido
delgado

• Penetra em uma das

lentes objetivas (ampliam a
imagem: 4,10, 40 ou 100
vezes)

• A imagem da objetiva
conflui e posteriormente é
aumentada pela ocular
(aumenta 10x)
https://www.morfofuncionando.com/introducao-a-microscopia
Métodos de estudo: microscopia
Microscópio óptico composto
Microscopia óptica (campo claro)

1. Ocular
2. Objetivas e revólver
3. Platina
4. Charriot
5. Macrométrico
6. Micrométrico
7. Diafragma do condensador
8. Condensador
9. Botão do condensador
10. Parafusos centralizadores do
condensador
11. Fonte de luz
12. Controle da iluminação
 Condensador
concentra a luz e
projeta feixe
luminoso sobre o
espécime (fonte
de luz com
espelho ou não)

Oculares e
objetivas: lentes
aumento

Imagem invertida
Parte óptica é constituída por:

Oculares e objetivas

Conjunto de lentes que

permitem a ampliação do
objeto. A ampliação
dada ao microscópio é
igual ao produto da
ampliação da objetiva
pela ampliação da ocular
 Microscopia: unidades e magnificações

Símbolo Unidade de medida Valor

m micrômetro 0,001 mm
nm nanômetro 0,001m

Ocular Objetiva Aumento

10 x 10x (pequeno aumento) 100x
10 x 40x (grande aumento a seco) 400x
10 x 100x (imersão em óleo) 1.000x

LIMITE DE RESOLUSÃO
Determina a riqueza de detalhes da imagem
Poder de resolução máximo de MO é de 0,2 m
Métodos de estudo: microscopia

Microscópio óptico

Ampliação total = aumento objetiva x

aumento ocular

Aumento real
Métodos de estudo: microscopia

Visualização de estruturas celulares não visíveis

ao microscópio óptico – poder resolutivo maior

Microscópio
eletrônico
CEMEL/UFMG
Métodos de estudo: microscopia

Microscópio eletrônico

➢ Tela fluorescente – sulfeto

de zinco (emite luz ao ser
excitada pelos elétrons)

✓ Elétrons incidem sobre filme

fotográfico – registro da
imagem – ampliadas 2-4 vezes
Métodos de estudo: microscopia

Os elétrons desviados não

contribuirão para formar a
imagem

• Estruturas escuras –
elétron-densas

• Componentes celulares que

desviam uma pequena parte
dos elétrons – tonalidades
cinza
Métodos de estudo: microscopia
Métodos de estudo: microscopia

Microscopia eletrônica de varredura

➢ Imagens tridimensionais (faz “varredura”)

➢Espécimes não precisam ser cortados

➢ Fixação (glutaraldeído)

➢ Recoberto com fina camada condutora

de eletricidade (ouro ou platina)

✓ Superfície de células em cultivo

Métodos de estudo: microscopia

Microscopia eletrônica
TRANSMISSÃO VARREDURA
Métodos de estudo: microscopia

Microscopia de contraste de fase

• Campo escuro
• Células vivas
Métodos de estudo: microscopia

Microscopia confocal
20X

• Imagem muito nítida

• Corantes fluorescentes
100X • Permite reconstituição
3D

Células epiteliais cultivadas, coradas em azul (núcleo),

verde (microtúbulos), e vermelho (actina)
 Técnicas Histológicas

O termo “Técnicas Histológicas” refere-

se ao conjunto de metodologias
empregadas para a obtenção de material
biológico
para estudo ao microscópio.
 Métodos de estudo: microscopia
Preparação das lâminas:
-Possibilidade de se usar material/células vivas
ou preservados
Métodos de estudo: microscopia

Etapas para preparação das lâminas:

-Coleta da amostra
-Fixação (formol ou glutaraldeído: ligam-se
aos grupamentos amínicos das proteínas)
-Processamento e inclusão
-Microtomia
-Coloração
Métodos de estudo: microscopia
Coleta da amostra

O fragmento de órgão ou tecido é retirado do animal/homem

anestesiado ou necropsiado e recortado em fatias finas de no
máximo 4 mm.
Métodos de estudo: microscopia
Coleta da amostra

• Consiste na obtenção da amostra que

pode ser feita de várias maneiras:

• Biópsia cirúrgica (incisão cirúrgica)

• Biópsia endoscópica (endoscopia)
• Biópsia por agulha (punção)
• Cirurgias amplas (peças grandes)
• Necropsia (ind. Morto)

O fragmento de órgão ou tecido devem ser clivados para

reduzir sua espessura permitindo fácil penetração do fixador
(fragmentos em torno de 4 mm de espessura
Métodos de estudo: microscopia

Etapas para preparação das lâminas:

-Coleta da amostra
-Fixação (formol ou glutaraldeído: ligam-se
aos grupamentos amínicos das proteínas)
-Processamento e inclusão
-Microtomia
-Coloração
 Métodos de estudo: microscopia

Fixação
• Esta etapa consiste na utilização
de procedimentos fisicos (calor ou
frio) ou químicos para preservação
do material

• Material deve ser imerso

rapidamente no fixador.
• O volume do fixador deve ser no
mínimo 10x maior que o volume da
peça coletada
• Tempo varia de acordo com o
tamanho da peça (Espessura de 4
mm : tempo mínimo 12 horas)
• O fixador inicia a sua ação da
periferia para o meio.
 Métodos de estudo: microscopia

Preparação das lâminas:

-Finalidades fixação:
-evitar autólise
-impedir atividade e proliferação bacteriana
-endurecimento das células
-preservar componentes celulares
-Microscopia óptica: aumentar afinidade pelos
corantes
- Microscopia eletrônica: aumentar contraste
 Métodos de estudo: microscopia

Preparação das lâminas:

-Coleta da amostra
-Fixação
-Processamento e inclusão
-Microtomia
-Coloração
Inclusão na parafina
Inclusão na parafina

Inclusão

• Permite seccionar a
amostra em camadas
delgadas

Bloco de parafina (ou resina)

Pequeno fragmento do órgão

 Inclusão
Antes de incluir na parafina líquida, é necessário
desidratar a peça, diafanizá-la e mergulhá-la em
parafina líquida.
• Desidratação - O material
é imerso em vários banhos
de álcool, em ordem
crescente de concentração,
até o álcool absoluto

• Diafanização (Clarificação) –
O material é imerso em xilol
(retirada completa do álcool
e água para que a parafina
penetre.

• Imersão em parafina – O
material é mantido em
parafina líquida, a 58 graus
(em estufa), por tempo
determinado.
 Métodos de estudo: microscopia

Preparação das lâminas:

-Coleta da amostra
-Fixação
-Processamento e inclusão
-Microtomia
-Coloração
Métodos de estudo: microtomia
 Microtomia
• Para que seja possível visualizar o tecido ao microscópio,
cortes finos devem ser realizados
• Para M.O.: cortes de 5* a 7m
• Para M.E.: cortes de 0,02-0,1 m

1 m=10-3mm

Fitas de parafina são cortadas Colocadas em banho-maria

(desaparecimento de dobras)
 Colagem do corte à lâmina
• Fitas de cortes são
separadas
cuidadosamente com
bisturi
• Faz-se um ponto de
aderência na
superfície da lâmina
de vidro
• Corte é
“pescado”com a
lâmina, na qual se
adere.
 Microtomia

Microscopia óptica Microscopia eletrônica

• Inclusão em • Inclusão em resinas

parafina rígidas (epóxi)

• Cortes de 1-6 • Cortes de 0,02-0,1

micrômetros micrômetros

• Navalhas de aço • Navalhas de vidro ou

diamante
 Métodos de estudo: microscopia

Preparação das lâminas:

-Coleta da amostra
-Fixação
-Processamento e inclusão
-Microtomia
-Coloração
Métodos de estudo: microscopia

Coloração
•A maioria dos tecidos é
incolor
Corantes

Evidenciam e selecionam
os componentes dos
tecidos
Métodos de estudo: microscopia

❖ As diferentes estruturas celulares interagem

praticamente da mesma forma com a luz
❖ O uso de substâncias coloridas com capacidade
de ligação diferencial a componentes químicos
específicos da célula permite a sua identificação e
localização.
❖ Para ser utilizada como corante, uma substância
deve possuir cor própria e capacidade de ligação
com grupos químicos específicos das células ou de
seus produtos.
Métodos de estudo: microscopia

Corantes
Existem muitos tipos de corantes.
Em geral podem ser agrupados em
três classes distintas:

• Corantes que diferenciam componentes

ácidos e básicos das células

• Corantes especializados que diferenciam

componentes da matriz

• Sais metálicos que precipitam nos tecidos

Métodos de estudo: microscopia

Coloração
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
• Consideram o caráter de acidez ou basicidade da
estrutura a ser corada

• Corantes ácidos:
– Coram estruturas básicas (acidófilas, eosinófilas)
– Eosina, verde-luz, fucsina ácida

• Corantes básicos:
– Coram estruturas ácidas (basófilas)
– Hematoxilina, azul de metileno
Métodos de estudo: microscopia

❖ Em pH fisiológico (aproximadamente 7,2) os

ácidos nucléicos (DNA e RNA) apresentam cargas
negativas, por isso eles têm afinidade por
componentes básicos
❖ Regiões celulares onde há o predomínio de
substâncias ácidas, como o núcleo, são chamadas
basófilas, por terem afinidade por corantes
básicos.
❖ O citoplasma também apresenta algumas
regiões basófilas, dada a presença de RNA
(principalmente o RNA ribossômico).
Métodos de estudo: microscopia

❖ As proteínas participam da composição de

quase todas as estruturas celulares.

❖ Grande parte das proteínas encontradas

no citoplasma tem afinidade por corantes
ácidos, o que confere a acidofilia
característica desta região da célula.
 Métodos de estudo: microscopia

❖ Uma das técnicas de coloração mais

utilizadas na citologia e histologia é a
coloração pela hematoxilina e eosina (HE).
❖ A hematoxilina, por ser um corante básico
(acidófilo), cora o núcleo (cor azul) devido aos
ácidos nucléicos aí presentes.
❖ A eosina, por ser um corante ácido
(basófilo), cora o citoplasma (cor rosa) dada à
predominância de proteínas básicas nesta
região da célula.
 COLORAÇÃO Hematoxilina-Eosina (H&E)
Coloração mais utilizada nos procedimentos histológicos

Hematoxilina: (cora componentes ácidos: Núcleo - DNA,RNA)

Eosina: Cora estruturas presentes no citoplasma

Núcleos se coram em azul

(hematoxilina) e Citoplasma em rosa
(eosina)
Métodos de estudo: microscopia

• Corantes básicos: azul de toluidina, azul de

metileno, hematoxilina

• Corantes ácidos: eosina, orange G e fucsina

ácida.
• P.A.S. (Periodic acid • Feulgen
Schiff- ácido periódico – Corante específico para
reativo de Schiff) DNA (rosa)
– Evidencia o glicogênio
– Coloração avermelhada
• Alcian blue • Fluorescência
– Cora glicoproteínas – Associação com anticorpos
– Coram substratos
específicos com substância
fluorescente

Em verde: microtúbulos
 Prata
Sudan negro - coloração de fibras
- coloração de lípides: preto reticulares: preto
 Tricrômico de Gomori Tricrômico de Mallory
- Cora fibras colágenas verde - Cora fibras colágenas em azul
Coloração de Verhoeff
Cora fibras elásticas em preto
 Coloração
TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS

• Maior especificidade e sensibilidade

• Permitem a identificação de componentes
específicos
• Exemplos:
– Imunofluorescência
– P.A.S.
– Alcian blue
– Feulgen
 Imuno-histoquímica

• Imuno-histoquímica ou IHQ é o processo de

detecção da expressão de proteínas localizadas nas
células dos tecidos utilizando o princípio
antígeno/anticorpo.
Métodos de estudo: microscopia

Interpretação dos cortes

Objetos

A B
C

Corte
A C
transversal
B

Corte
A B longitudinal
C
 Interpretação de cortes histológicos

•Para analisar uma

lâmina deve-se
primeiramente entender
o que se está
observando.

• As estruturas se
apresentam de modo
distinto quando cortadas
transversalmente ou
longitudinalmente.

Planos de corte
Métodos de estudo: microscopia

Problemas!!!!
-Distorção do material devido à retração
causada pelo fixador – formação espaços
artificiais nos tecidos;
-Perda moléculas que não foram mantidas
corretamente – espaços artificiais;
-Pregas no corte histológico;
-Precipitados de corantes...

Artefatos
Métodos de estudo: microscopia

Pêlo/fibra
Precipitado de corante
Microscopia
• A lâmina que vocês observarão no
decorrer do curso demora HORAS para
ser confeccionada

– Fixação: 24-72h
– Inclusão: 4-5h
– Microtomia (corte): 10min (variável)
– Coloração: 1h

• Por isso, é necessário que tenham

CUIDADO com esse material
 GUIA HISTOLOGIA on line

http://www.histologyguide.com/slidebox/slidebox.html

http://depto.icb.ufmg.br/dmor/hem/atlas_histologico.html
Lâmina 14
Pele palmar (coloração T. Mallory)

Cora fibras colágenas em azul

Lâmina 51
Pele palmar (coloração HE)

Cora núcleo em roxo e citoplasma em rosa

Lâmina 66
Glândula submandibular (T. Gômori)

Cora fibras colágenas em verde

Lâmina 15 Diversos órgãos
Coloração Verhoeff
( cora fibras elásticas em preto)
Lâmina 15 Diversos órgãos
Coloração Verhoeff ( cora fibras elásticas em preto)
 LÂMINAS DO BLOCO I

Corantes: pele 51 (H.E.), pele 14 (Tricômio de

Mallory), submandibular 66 (HE), diversos órgãos 15
(fibras elásticas Verhoeff), epidídimo 01 (Aoyama –
Complexo de Golgi), fígado 02 (Pollak – mitocôndrias),
fígado 08 (Feulgen – DNA), raiz cebola 06 (fases da
mitose), fígado (PAS – glicogênio), Alcien Blue
(glicoproteínas)
ATLAS ON LINE

https://mol.icb.usp.br/

http://depto.icb.ufmg.br/dmor/hem/atlas_histolog
ico.html

http://www.histologyguide.com/slidebox

https://www.ufrgs.br/livrodehisto/

http://anatpat.unicamp.br/
Até nossa
próxima
aula!!
Cuidem-se
☺