UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE – FURG

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – ICB

PRÁTICAS EM BIOLOGIA CELULAR

ROTEIRO DA DISCIPLINA DE PRÁTICAS EM BIOLOGIA CELULAR

MICROSCOPIA

Microscopia Óptica
Parte mecânica:
1. Pé
2. Braço
3. Tubo ou canhão
4. Revólver
5. Platina
6. “Charriot”
7. Macrométrico e micrométrico.

Parte óptica:
- Sistema de lentes:
8. Oculares
9. Objetivas
10. Condensador
11. Espelho ou Luz
12. Intensidade da Luz
13. Liga/desliga

Observações:
1. A imagem proporcionada pelo M.O. é aumentada, virtual e invertida em
relação ao objeto examinado.
2. Calcula-se o aumento da imagem obtida ao M.O. multiplicando-se o valor do
aumento da ocular pelo valor do aumento da objetiva.
3. Campo microscópico é a área da preparação que se está observando ao M.O.
Quanto maior o aumento da imagem, menor é a abrangência do campo.
4. Em virtude do último item, sempre ao iniciar a observação ao M.O. usa-se
uma combinação de lentes que proporcione um menor aumento, a fim de se
obter uma visão panorâmica da preparação; depois se usa uma combinação de
lentes que proporcione um maior aumento, permitindo a visualização de
detalhes do
campo microscópico.

MANEJO DO MICROSCÓPIO
1. Acender a lâmpada do sistema de iluminação.
2. Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador/diafragma na
posição mais elevada, pois é aquela que permite melhor iluminação.
3. Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de menor aumento.
4. Posicionar a lâmina com a lamínula para cima colocando-a na platina,
prendendo-a com o(s)
grampo(s).
5. Movimentar o “charriot”, fazendo com que o preparado fique embaixo da
objetiva.
6. Com o parafuso macrométrico, elevar a platina ao máximo, observando que
a objetiva não toque a lamínula, pois poderá quebrá-la.
7. Focalizar a preparação, quer dizer, obter uma imagem nítida, movimentando
o parafuso macrométrico e abaixando a platina até que se possa visualizar a
imagem.
8. Aperfeiçoar o foco com o parafuso micrométrico.
9. Colocar a região do preparado que se quer ver com maior aumento bem no
centro do campo visual da lente.
10.Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de 10X.
11.Repetir o procedimento do item 6.
12.Para focalizar a nova imagem, repetir o procedimento do item 7.
13.Repetir o item 8.
14.Repetir o item 9.
15.Colocar a objetiva de 40X em posição e repetir os itens 6, 7 e 8.
16.A objetiva de 100X é chamada de imersão e seu uso será explicado
posteriormente.

OBSERVAÇÕES:
1. A maior parte de nossos microscópios possuem lentes parafocais. Isto
significa que, uma vez obtido o
foco com a objetiva de menor aumento, basta girar o revólver, colocar a
próxima objetiva em posição e
acertar o foco apenas com o parafuso micrométrico.
2. O aluno deverá repetir várias vezes às operações descritas a partir do item
3, a fim de atingir maior
desenvoltura no manuseio do microscópio óptico.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
CONFECÇÃO DE LÂMINAS
(preparados histológicos permanentes)

Sob este título estudaremos os passos para a obtenção de um preparado

histológico permanente, denominado lâmina histológica, e que serão descritos a
seguir:

1.Coleta de material: é a obtenção da peça, por biópsia ou necropsia.

2.Fixação: o tratamento assim denominado visa impedir a destruição das células

por suas próprias enzimas (autólise), ou por bactérias. Este tratamento é feito
imediatamente após a retirada do material: após a biópsia, a necropsia ou até
antes, quando a fixação é feita por perfusão do animal. A fixação visa ainda
endurecer os tecidos, tornando-os mais resistentes e favoráveis às etapas
subseqüentes da técnica histológica. Resumindo, pode-se dizer que a fixação é
o tratamento da peça histológica a fim de que possamos observar ao microscópio
os componentes teciduais, com a morfologia e a composição química
semelhantes a existente no ser vivo. A fixação pode ser feita por processos
físicos ou químicos. A fixação química, mais usada em Histologia é feita por
fixadores que podem ser simples ou Compostos. Como exemplo de fixador
simples temos o formol, e de composto citamos o Bouin (uma mistura de formol,
ácido pícrico e ácido acético).

3.Desidratação: visa retirar a água dos tecidos, a fim de permitir a impregnação

da peça com parafina. Para isto, a peça é submetida a banhos sucessivos de
álcoois de teor crescente.

4.Diafanização: visa impregnar a peça com um solvente de parafina. O mais

usado é o xilol.

5.Impregnação pela parafina fundida: tem a finalidade de permitir a obtenção

de cortes finos. Para isto se submete a peça a banhos de parafina a 60ºC, no
interior da estufa. Em estado líquido, a parafina, penetra nos tecidos, dando-lhes,
depois de solidificada, certa dureza e homogeneidade na dureza ao corte.

6.Inclusão: é a passagem da peça que estava na estufa para um recipiente

retangular contendo parafina fundida que, depois de solidificada à temperatura
ambiente, dá origem ao chamado “bloco de parafina”. A inclusão pode também
ser feita com celoidina, gelatina ou resina epóxi, sendo esta última usada
também para microscopia eletrônica.

7.Microtomia: é a etapa em que se obtém cortes finos de peças incluídas na

parafina, através de um aparelho chamado micrótomo, que possui navalha de
aço. A espessura dos cortes geralmente varia de 3 a 10 micrômetros.

8.Extensão: os cortes provenientes da microtomia saem pregueados

(enrugados). Para desfazer estas rugas, são distendidos (esticados) num banho
de água e gelatina a 37ºC, e “pescados” com uma lâmina. Levase então, à estufa
a 40ºC por no mínimo 2 horas, para que se dê a colagem do corte à lâmina, e
para que escorra a parafina em volta do corte.
9.Coloração: tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos,
tornando-os visíveis e destacados uns dos outros. Para realizá-la, são
observados 3 itens:

· Eliminação da parafina: por meio de banhos sucessivos em xilol, benzol, ou

toluol.
· Hidratação: é executada quando o corante utilizado é solúvel em água. Deve
ser gradativa, com
álcoois de teor decrescente, para evitar o rompimento dos tecidos.
· Coloração: os corantes são compostos químicos com determinados radicais
ácidos ou básicos que possuem cor e afinidade de combinação com estruturas
básicas ou ácidas dos tecidos. Rotineiramente, usa-se Hematoxilina, corante
básico, que se liga a radicais ácidos dos tecidos, e Eosina, corante ácido que
tem afinidade por radicais básicos dos tecidos. Os componentes que se
combinam com corantes ácidos são chamados acidófilos. Por exemplo, os
núcleos das células, onde predominam substâncias ácidas, coram-se pela
hematoxilina (corante básico de cor roxa), o citoplasma, onde predominam
substâncias básicas, se cora pela eosina (corante ácido de cor rosa).

10.Desidratação: visa retirar a água (quando os corantes utilizados forem

soluções aquosas) a fim de permitir perfeita visualização (pois a água possui
índice de refração diferente do vidro) e ainda prevenir a difusão dos corantes.
Para isto usam-se banhos em álcoois de teor crescente.

11.Diafanização: é feita com xilol, a fim de tornar os cortes perfeitamente

transparentes.

12.Montagem: é a etapa final da técnica histológica e consiste na colagem da

lamínula sobre o corte, com bálsamo do Canadá ou Sintético, que é solúvel em
xilol e insolúvel em água. A lamínula impede que haja hidratação do corte no
meio ambiente, permitindo então que estas lâminas se mantenham estáveis por
tempo mais longo. Após a montagem, levam-se as lâminas a estufa para a
secagem do bálsamo e agora estão prontas para o uso.
LÂMINAS DOS GRUPOS

Após confeccionarem as lâminas, agora chegou o momento da visualização ao

microscópio. Visualize as lâminas em todas as objetivas e esquematize a
amostra. Faça também o esquema das amostras dos colegas de outros grupos.
POSICIONAMENTO

O posicionamento da amostra é muito importante para se ter um bom diagnóstico

do que se pretende identificar. Além disso, caso a mesma amostra pode em
posicionamento de corte diferente, se apresentar muito desigual na visualização
ao microscópio.

Para a aula de hoje vamos fazer cortes longitudinais a 0º e 90º e transversais.

Vamos utilizar ovo cozido, laranja e cenoura.

LONGITUDINAL OVO 0º LONGITUDINAL OVO 90º OVO TRANSVESRAL

LONG. LARANJA 0º LONG. LARANJA 90º LARANJA TRANSVERSAL

LONG. CENOURA 0º LONG. CENOURA 90º CENOURA TRANSVESAL

AULA BACTÉRIAS

As bactérias são representam dos procariontes, os quais se caracterizam por

serem indivíduos com células pequenas e sem a presença do núcleo.
Para esta aula usaremos as bactérias do yogurt (Lactobacillus) para a
visualização.

Protocolo:

1- Com a pipeta Pasteur adicione a uma lâmina duas gotas do yogurt

2- Com uma pinça, passe a lâmina 3X pela lamparina
3- Retire o excesso do yogurt
4- Com a pipeta Pasteur adicione duas gotas do corante e espere por 1 min
5- Retire o excesso de corante
6- Coloque a lamínula
7- Visualize no microscópio
EXTRAÇÃO DE DNA DE MORANGO

Materiais:

- Um morango (fresco ou congelado).

- Um saco plástico tipo “Zip loc”.
- 50 ml de detergente de cozinha transparente.
- 15g de sal de cozinha (+- duas colheres de chá).
- 200 ml de água filtrada ou destilada (preferência mineral).
- Um funil.
- Um filtro de papel.
- Um tubo de ensaio.
- Um bastão de vidro.
- Álcool etílico gelado (álcool a 90º g.l).
- Gelo.

OBS:

1. O saquinho do tipo “Zip loc” deve ser bem espesso. Quanto mais
espesso, mais resistente. Geralmente os saquinhos utilizados para
embalar comidas no freezer são apropriados.
2. Kiwi ou banana também podem ser utilizados.
3. O álcool deve estar muito gelado. Resfrie-o em banho-maria com
gelo e água algum tempo antes da experiência.
Procedimentos:
- Coloque um morango, previamente lavado e sem as sépalas em um
saco zip loc.
- Esmague o morango com o punho por, no mínimo 02 minutos.
- Adicione a solução de extração ao conteúdo do saco.

Solução de extração:

50 ml de detergente + 15g de sal de cozinha + 200 ml de água mineral.

- Misture tudo, apertando com as mãos, por 01 minuto.

- Derrame o extrato no aparato filtrante e deixe filtrar diretamente dentro do tubo
de ensaio. Não encha totalmente o tubo (encha somente até 1/8 do seu volume
total).
- Incline o tubo com o líquido filtrado (em ângulo de 30 a 40º) e derrame
vagarosamente, pela parede, o álcool gelado até que o mesmo esteja cheio pela
metade. Você verá que o álcool não se mistura prontamente com a solução
filtrada, formando duas fases (na superfície fica o álcool). Entre as duas fases é
possível observar a formação de um precipitado com aspecto de fiapos
esbranquiçados, que são as moléculas de DNA.
- Com a ajuda do bastão, é possível enrolar as moléculas que estão precipitando,
ou seja, você pode pescar o DNA da cebola. Faça movimentos circulares
cuidadosos, não mexa muito para não quebrar as moléculas de DNA.
- Os fios esbranquiçados e grudentos formados são aglomerados de muitas
moléculas de DNA e ficarão presos na ponta do bastão de vidro.
- Deixe secar sobre uma estante e ressuspenda o DNA em água ou solução de
cloreto de sódio a 4%.
AULA DE BETERRABA

Vamos aprender o que acontece quando colocamos cubos de beterraba em

diferentes situações.
Colocaremos os cubos por 10 min em um Becker contendo 200 mL de água em
temperatura ambiente, cubos em um Becker contendo 200 mL de água à 100ºC,
cubos em um Becker com 200 mL de álcool 96% e cubos com 200 mL de acetona
100%. Anote o que acontece durante os 10 min.
Retire um cubo de cada Becker e coloque em uma placa de petri. Anote o que
aconteceu.
Coloque cada cubo que você colocou na placa de petri em um novo Becker
contendo água temperatura ambiente. Anote o que aconteceu.
AULA PROTOZOÁRIO E FUNGO

Os protozoários são indivíduos eucariontes que apresentam muitas formas e

tamanhos e são encontrados em muitos lagos e laguinhos. Já os fungos são
representados pelos mofos e bolores e são eucariontes que apresentam
tamanhos e formas diferenciados também.

PROTOZOÁRIOS

Protocolo:

1- Com a pipeta Pasteur adicione uma gota de água do Becker

2- Coloque a lamínula
3- Visualize no microscópio

FUNGOS

Protocolo:

1- Com uma espátula adicione o fermento na lâmina

2- Com a pipeta Pasteur adicione duas gotas do corante e espere 5 min
3- Cole a lamínula
4- Visualize no microscópio
AULA ELODEA

Visualizaremos uma amostra de um vegetal na microscopia.

Protocolo:
1- Pegue uma folha da Elodea e coloque na lâmila com duas gotas da
mesma água em que ela se encontra.
2- Coloque a lamínula
3- Observe no microscópio
4- Depois, acrescente uma solução com NaCl
5- Observe no microscópio
AULA CÉLULA BUCAL

Visualizaremos uma célula bucal.

Protocolo:

1- Com uma haste de algodão (cotonete) passe pela parte interna da

cavidade oral.
2- Após espalhe a amostra sobre uma lâmina
3- Coloque duas gotas do corante e espere 5 min
4- Coloque a lamínula
5- Retire o excesso de corante com papel filtro
6- Observe no microscópio
AULA MITOSE

Visualizaremos as fases da mitose na raiz de cebola.

Preparo da amostra:

1- Raspe as raízes da cebola

2- A cebola deve ser colocada em contato com água e ficar por 7 dias

Protocolo:

1- Após, os 7 dias, as novas raízes devem ser coletadas e acrescentadas a

uma placa de petri em meio Carnoy por 5 min
2- Em seguida, devem ser realizadas 3 lavagens de 10 min da amostra em
água destilada
3- Depois, as raízes são secas em papel filtro
4- Em seguida, são colocadas em ácido clorídrico 1N sob a temperatura de
60ºCpor 10 min em banho maria
5- Após, o material é colocado em água gelada
6- Coloque uma amostra da raiz em uma lâmina
7- Acrescente uma gota de ácido acético 45%
8- Separe o meristema da raiz com duas seringas
9- Depois, fragmente o meristema
10- Em seguida, remova o excesso de ácido acético com um papel filtro
11- Adicione uma gota de orceína 2%
12- Aqueça a amostra na lamparina por 3X ida e volta
13- Coloque a lamínula
14- Bata com um palito de fósforo sobre a lamínula
15- Após, faça um tipo de sanduíche com um papel filtro sobre a lâmina
16- Observe no microscópio
AULA DE EPERME VEGETAL

Protocolo:

1- Descasque uma cebola

2- Remova um pedaço de seus catafilos
3- Na sua parte interna, removemos um pedaço de sua epiderme
4- Transfira a amostra para uma placa de petri com água destilada
5- Pegue um fragmento e coloque na lâmina
6- Coloque a lamínula
7- Observe no microscópio
8- Na amostra que está na placa de petri duas gotas do corrante e espere 5
min
9- Pegue um fragmento e coloque na lâmina
10- Coloque a lamínula
11- Observe no microscópio