FACULDADE ESTÁCIO DO AMAZONAS

BIOMEDICINA

Roteiro – Aula Prática

PROFESSORA: EVENY MARINHO
Título:

Microscopia e Colorações

Objetivos: Material:

• Conhecer as normais de biossegurança no laboratório de microbiologia

• Reconhecer as principais partes de um microscópio óptico;
• Aprender a manuseá-lo corretamente;
• Realizar a coloração de Gram;
• Diferenciar a forma e o tipo de bactéria de acordo com a coloração
• Identificar diferentes grupos de bactérias através das colorações de Gram e Ziehl-Neelsen.

Técnicas de Colorações

Para microscopia:
• Lâminas;
• Solução salina 0,9%;
• Alças bacteriológicas
• Óleo de imersão;
• Microscópio.

Coloração de Gram:
• Kit coloração Gram; ou
• Violeta Genciana;
• Lugol;
• Álcool-acetona ou Álcool absoluto;
• Fucsina fenicada.

Coloração de Ziehl:
• Kit coloração Ziehl; ou
• Fucsina fenicada;
• Álcool-ácido 3%;
• Azul de metileno
 Observação:

• Antes de iniciar a técnica, tome cuidado com os seguintes tópicos:

• A alça de platina deve ser esterilizadas por flambagem antes e após qualquer cultivo. Tome cuidado
de esfriá-la antes da semeadura.
• Os recipientes devem sempre ser abertos próximo à chama do bico de busen.
• Deve-se evitar ao máximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo.
• Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao máximo perfurar ou rasgar o ágar, pois
poderá ocorrer acúmulo de bactérias neste setor do meio, além de alterar as condições de crescimento
bacteriano.
• A flambagem consiste em aquecer a alça de platina, por exemplo, na chama da lamparina até que
esta fique vermelha incandescente. Além de flambar a alça, é preciso flambar todo o cabo, de modo a
descontaminá-lo (este não precisa ficar vermelho), para realizar a técnica.
• A técnica de esgotamento por estrias é um dos diversos métodos de semeadura empregado com
frequência na rotina laboratorial. Nesta, são realizadas estriações no meio de cultivo sólido em placa
de Petri.

Colorações

Coloração de Gram

• Colocar algumas colônias da bactéria na lâmina do microscópio, podendo ser acrescentando uma gota
de soro fisiológico 0,9% para facilitar a homogeneização das colônias;
• Deixar secar um pouco, podendo passar rapidamente a lâmina por uma chama para favorecer a
secagem. No entanto é importante ter atenção à temperatura, já que se a temperatura for muito alta é
possível que haja alteração na estrutura das bactérias, o que pode interferir no resultado do exame;
• Cobrir com o corante cristal violeta e deixar agir por cerca de 1 minuto, quando a lâmina estiver seca;
• Lavar a lâmina com água corrente e cobrir a lâmina com o lugol, que tem como objetivo fixar o
corante azul, e deixar agir por 1 minuto.
• Lavar novamente a lâmina com água corrente e aplicar álcool a 95%, deixando agir por 30 segundos.
O álcool é responsável por dissolver a membrana de lipídios formadora das bactérias gram-negativas
e, assim, remover o complexo formado entre o corante e o lugol, descorando essas bactérias.
• Lavar mais uma vez a lâmina em água corrente e cobrir com o segundo corante, a fucsina ou
safranina, e deixar agir por 30 segundos;
• Lavar a lâmina com água corrente e deixar secar à temperatura ambiente.
• Colocar uma gota de óleo de imersão e observar a lâmina no microscópio com objetiva de 100x, assim
que a lâmina estiver seca. No microscópio será possível verificar a presença ou ausência de bactérias,
bem como a presença de leveduras e células epiteliais.
• Esperar secar;
• Observar no microscópio em objetiva de imersão (100x).
MICROSCOPIA ÓPTICA

No curso de Biomedicina, o uso do microscópio óptico (M.O) é importante, sendo um dos

principais instrumentos para o diagnóstico laboratorial, este é instrumento que permite observações
que estão fora do alcance resolutivo do olho humano. Com auxílio da microscopia, células e muitas
estruturas subcelulares dos seres vivos podem ser estudadas sob vários aspectos morfofisiológicos.
O microscópio óptico é constituído por duas partes: a mecânica e a óptica. A primeira,
responsável pela estabilidade e pelo suporte ao sistema óptico, compõe-se de pé ou base, coluna ou
estativa (com um parafuso macrométrico, para uma primeira focalização, e um micrométrico, para
detalhar a imagem), mesa ou platina (com charriot que movimenta a lâmina para frente, para trás e
lateralmente, e parafuso, que movimenta o conden sador), e o tubo ou canhão (com o revólver). A
parte óptica contém três sistemas de lentes – oculares (encaixa no tubo do M.O), objetivas (rosquea
das ao revólver) e condensador (situado sob a platina) –, além de uma fonte luminosa (na base) e um
diafragma (alavanca abaixo da platina). A inten sidade da luz pode ser controlada por um botão
(regulagem de 1 a 10, na base), que regula a aproximação ou o distanciamento do condensador (em
relação à mesa), e pela abertura-fechamento do diafragma (para maior ou menor passagem da luz).
Deve-se proceder o correto manuseio do M.O, bem como estar atento ao seu transporte e a sua
manutenção.
A qualidade de um microscópio está associada ao poder de resolução/PR (capacidade real para
definir detalhes, dependente de fabricação) e ao limite de resolução/LR (capacidade resolutiva
teórica/calculada, cor respondente à menor distância entre dois pontos para que sejam visualizados
separadamente). O objeto a ser observado deve ser focalizado com o macrométrico, para que se forme
uma imagem real, invertida e aumentada (cuja riqueza de detalhes é fornecida pela objetiva). A
ampliação total é calculada pelo aumento da ocular (10x) multiplicado (4, 10, 40, 100x) pelo da
objetiva, resultando em 40, 100, 400 e até 1000 vezes de aumento real.Lente ocular;

1- Tubo binocular;
2- Parafuso de fixação;
3- Revólver com lentes objetivas;
4- Cabeçote;
5- Braço ou coluna;
6- Platina ou mesa;
7- Condensador;
8- Diafragma do condensador;
9- Manipulador da lente do condensador;
10- Parafusos de centralização do condensador;
11- Porta-filtros; 13- Suporte para lente auxiliar;
12- Parafuso macrométrico e parafuso micrométrico;
13- Suporte da lâmpada;
14- Diafragma de iluminação;
15- 17- Pé ou base.
1) Cite a partes de um microscópio óptico conforme a imagem abaixo.

2) Desenhe o que você visualizou no microscópio e cite o aumento utilizado: ___________