Integrado em Química

Disciplina de Microbiologia
Professora Vanessa Coelho

Prática de Coloração de Gram

Introdução:

Esse método, desenvolvido em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian

Gram, permite diferenciar as bactérias em gram-positivas e gram-negativas, segundo
características da parede celular. Permite ainda a visualização da morfologia bacteriana
(cocos e bacilos) e dos arranjos entre as células (isoladas, em cacho, em cadeias). A
camada mais espessa de peptideoglicano nas bactérias gram-positivas impede a remoção
fácil do complexo cristal violeta-lugol e assim, essas células permanecem coradas de
roxo.

Objetivos:

1. Aprender a preparar esfregaço de bactérias;

2. Realizar a técnica de Coloração de Gram;
3. Aprender o fundamento do método de coloração de Gram;
4. Comparar a estrutura da parede celular das bactérias Gram-positivas e Gram-
negativas;
5. Permitir a observação da morfologia bacteriana e fornecer informações a
respeito do comportamento do seu material celular diante dos corantes de Gram.

Material necessário:
 Lâminas;
 Swab;
 Tudo de ensaio;
 Soro fisiológico ou água destilada;
 Pipetas Pasteur;
 Bico de Bunsen;
 Kit de Coloração de gram:
o Corantes: violeta-de-metila e fucsina;
o Fixador: lugol;
o Descorante: álcool-acetona a 30% ou álcool etílico (99,5ºGL);
 Óleo de imersão;
 Quadro Branco;

Atividade prática:

Cada grupo realizará uma coloração de GRAM a partir de esfregaços realizados

a partir de amostras coletadas de diferentes locais (orofaringe, celular, dinheiro, sapato
etc.) com “swab estéril”, fazendo um esfregaço em lâmina de vidro, fixando e corando.
Adicionalmente, cada grupo deverá observar esfregaços fixados e corados que ficaram
disponíveis nos microscópios (aumento 100x).
Técnica:

Amostra:
 Coletar amostra com swab seco estéril (orofaringe, celular, dinheiro, sapato
etc.);
 Colocar 1 gota de solução salina (soro fisiológico a 0,9%) num tubo de ensaio;
 Inserir o swab com a amostra no tubo de ensaio e rotacionar cuidadosamente
para lavar;
 Coletar 1 gota dessa solução com pipeta Pasteur;

Preparo da Lâmina:

 Pegar uma lâmina limpa e flambar no bico de Bunsen;

 Identificar o lado onde será feito o esfregaço;
 Pingar 1 gota da solução salina (contendo a amostra coletada) na lâmina;
 Cobrir o esfregaço com violeta-de-metila, violeta genciana ou cristal violeta por
1 minuto;
 Lavar com filete de água (inclinar lâmina para que o filete de água não caia
diretamente sobre a amostra);
 Cobrir com lugol (fixador) por 30 segundos;
 Escorrer excesso do lugol;
 Descorar com álcool-acetona e lavar imediatamente (inclinar lâmina para que o
filete de água não caia diretamente sobre a amostra);
 Cobrir a lâmina com fucsina por 30 segundos;
 Lavar novamente em água corrente (inclinar lâmina para que o filete de água
não caia diretamente sobre a amostra);
 Secar a lâmina, pressionando-a levemente entre duas folhas de papel de filtro,
com o cuidado para não remover o esfregaço corado;
 Observar ao microscópio, com objetiva de imersão (objetiva 100X);

Obs.: após a coloração, cuidado para não inverter a face da lâmina com as bactérias;

Observação:
Soluções em ordem de Reação do aspecto das
aplicação bactérias Gram-positivas
Violeta-de-metila Coradas em violeta
Solução de Lugol Formação do complexo
cristal violeta-lugol no
interior da célula, que
permanece violeta
Álcool-acetona Desidratação da parede
celular, diminuição da
porosidade e da
permeabilidade; o
complexo cristal violeta-lugol
não pode sair
da célula, que permanece
violeta
Reação do aspecto das
bactérias Gram-negativas
Coradas em violeta
Formação do complexo
cristal violeta- lugol no
interior da célula, que
permanece violeta
Extração dos lipídeos da
parede
celular, aumento da
porosidade;
o complexo cristal violeta-
lugol é removido da
célula
Fucsina A célula não é afetada e A célula adquire o corante,
permanece violeta tornando-se vermelha
Questões para relatório

1- Desenhe cada tipo de célula observada na prática e classifique quanto a

morfologia e se são gram-positivas ou gram-negativas.

2- Discorra sobre a diferença entre as células Gram-positivas e Gram-

negativas, considerando a coloração de gram como uma ferramenta
diagnóstica. Quais são as principais características que permitem essa
distinção?

3- Comente sobre a relevância clínica da coloração de gram em microbiologia.

Como os resultados obtidos podem influenciar o tratamento de infecções
bacterianas? Dê exemplos de situações em que a coloração de gram é
fundamental para o diagnóstico preciso.