COLORAÇÃO DE GRAM (Hans Christian Joachim Gram)

Todas as estruturas celulares são coradas pelo corante cristal violeta. Com a adição do mordente
(Lugol), ocorre a formação do complexo iodo-pararosanilina, que fixa o corante primário nas
estruturas coradas. O álcool-acetona extrai os lipídeos, aumentando a porosidade/permeabilidade da
parede celular das bactérias Gram-negativas. O complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado
e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias gram-positivas, em
virtude de sua composição, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, a
porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CVI não pode ser extraído.

Preparo do esfregaço:

1- Pegar uma lâmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do bico de Bunsen;

2- Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço;

3- Flambar a alça bacteriológica e deixá-la esfriar, colocar na cultura teste e esfregar o material da
alça bacteriológica para se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme;

4- Deixar secar nas proximidades da chama;

5- Fixar o esfregaço passando a lâmina rapidamente na chama do bico de Bunsen.

Método de Coloração de Gram:

1- Cobrir toda a lâmina com solução cristal violeta (corante roxo), aguardar um minuto;

2- Lavar rapidamente em água destilada;

3- Cobrir a lâmina com solução de Iugol (mordente) por um minuto;

4- Lavar em água destilada;

5- Inclinar a lâmina e gotejar álcool-acetona (cerca de 15 segundos) e lavar a lâmina rapidamente

em água corrente;

6- Cobrir com fucsina de gram e aguardar 30 segundos;

7- Lavar a lâmina em água destilada, deixar secar e observar ao microscópio com a objetiva de
imersão (100X).

Em culturas envelhecidas as células Gram-positivas podem se tomam Gram-negativas.

Soluções em ordem Reação do aspecto das bactérias Reação do aspecto das

de aplicação Gram-positivas
Cristal violeta Coradas em violeta.
Formação do complexo CV-I no interior da
Solução de Iugol
célula, que permanece violeta.
Desidratação da parede celular, diminuição
da porosidade e da permeabilidade; o
Álcool-acetona
complexo CV-I não pode sair da célula,
que permanece violeta.
Fucsina ou safranina A célula não é afetada, permanece violeta.
bactérias Gram-negativas
Coradas em violeta.
Formação do complexo CV-I no
interior da célula, que permanece
violeta.
Extração dos lipídeos da parede
celular, aumento da porosidade;
o complexo CV-I é removido da
célula.
A célula adquire o corante,
tornando-se vermelha.
 COLORAÇÃO DE ZIEHL NIELSEN (Franz Ziehl e Friedrich Neelsen)

Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente à
descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Estas são bactérias ácido-álcool
resistentes (gêneros Mycobacterium e Nocardia). Esta característica é devida ao elevado teor de
lípidos estruturais (ex. ácido micólico) na parede celular destas bactérias, que provoca uma grande
hidrofobicidade, dificultando a ação dos mordentes e diferenciadores de corantes aquosos.

Preparo do esfregaço:

1- Pegar uma lâmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do bico de Bunsen;

2- Identificar o lado da lâmina onde será feito o esfregaço;

3- Flambar a alça bacteriológica deixá-la esfriar, colocar na cultura teste e esfregar o material com
movimentos de rotação da alça bacteriológica, para se obter um esfregaço de forma oval, bem
fino e uniforme;

4- Deixar secar nas proximidades da chama;

5- Fixar o esfregaço passando a lâmina (lado oposto ao esfregaço) 5 vezes na chama do bico de
Bunsen (rapidamente).

Método de Coloração de Ziehl Nielsen:

1- Cobrir toda a lâmina com com fucsina fenicada;

2- Aquecer em chama até emitir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos;

3- Lavar a lâmina em água suavemente;

4- Colocar álcool-ácido clorídrico até que não se desprenda mais corante;

5- Lavar a lâmina com água;

6- Cobrir o esfregaço com azul-de-metileno por trinta segundos;

7- Lavar a lâmina com água;

8- Deixar secar e observar ao microscópio com a objetiva de imersão (100X).

Soluções em ordem BAAR BNAAR

de aplicação Bactérias álcool ácido resistentes Bactérias não-álcool ácido resistentes
Fucsina de Ziehl Bactérias coradas em vermelho. Bactérias coradas em vermelho.
A fucsina não se fixa nos componentes
A fucsina se fixa nos lipídeos
da parede celular e abandona a célula,
Álcool-ácido clorídrico complexos e não abandona a
que permanece sem corante em seu
célula, que permanece vermelha.
interior
A célula não é afetada e permanece A célula adquire o corante, tornando-se
Azul-de-metileno
vermelha. azul