FACULDADE DE CIÊNCIAS DE SAÚDE

 
Disciplina: Microbiología e Parasitología I
Curso: Medicina, Medicina dentaria e Farmacia
Ano: 2
Tema 1.
Título: Microscopia e coloração
 

Sumario:
Microscopia. Conceito. Tipos de microscópios. Utilidade
Corantes. Tipos. Fundamentos. Aplicativos. 
Objectivos
1. Explicar as vantagens e limitações dos
diferentes tipos de técnicas microscópicas ópticas
e electrónicas, destacando a sua aplicação em
laboratórios de Microbiologia Médica e
Parasitologia.

2. Analisar a utilidade dos diferentes métodos de

coloração utilizados em laboratórios de
Microbiologia Médica e Parasitologia, com ênfase
em seus fundamentos e usos.
MICROSCOPIA

A microscopia é a ciência que trata dos usos e

aplicações interpretativas dos microscópios, que
possibilitam que partículas muito pequenas
sejam percebidas pelo olho humano.
 Microbiología e Parasitología Médicas

Tipos de Microscopía

• De campo claro
1:- Microscopía óptica ou de luz
• De campo oscuro
•De fluorescencia

2:- Microscopía electrónica

UNIDAD

O microscópio de luz
•É formado por um sistema de lentes e utilizado para iluminar um feixe de luz.
Amplie imagens até 1000 vezes. Seus principais componentes são:

Oculares. Lentes através das quais a

preparação ampliada é observada.

Objetivos. Lentes que aumentam o tamanho

da imagem.

Prato. A preparação é colocada sobre ela, que

é segurada com uma pinça.

Iluminação. Espelho ou lâmpada que ilumina a

preparação.

Parafusos de foco. Mova o palco para cima ou para

baixo para focar a imagem.
O lente objectivo é o determinante mais importante da
qualidade da imagem produzida pelo microscópio.

A ampliação total de um microscópio de luz é calculada

multiplicando o poder de ampliação da lente objectiva
pela da lente da ocular.

Exemplo: ocular (10X) e objetivo (40X): 10 x 40

= 400 diâmetros de ampliação.

Os microscópios usados ​em bacteriologia geralmente usam
objectivos de 90 ou 100 ampliações com oculares de 10
diâmetros, ampliando de 900 a 1.000 vezes.

A microscopia de campo de luz é mais comumente usada

para visualizar esfregaços corados, mas também pode ser
usada para examinar características morfológicas e a
mobilidade de organismos em montagens úmidas.
Imagens obtidas com o microscópio de luz

•Este tipo de microscópio

permite observar células
vivas e os movimentos
que elas fazem,
mantendo-as em seu
ambiente.

Protozoos
•Também permite que o tecido seja
observado em cortes finos, mas neste
caso as amostras devem ser fixadas
para que as células fiquem mortas.

• Para melhor visualização das

amostras, elas podem ser coradas
com corantes específicos que
destacam estruturas como o núcleo
ou a parede celular.

Células vegetales
Células animales
MICROSCOPIA DE
CONTRASTE DE FASE:
diferenciar as estruturas
internas das células vivas
sem coloração.
Ele aproveita as pequenas
diferenças nos índices de
refração em diferentes partes
de uma célula ou tecido.
MICROSCOPIA DE
CAMPO ESCURO

Cria um campo escuro que

produz contraste contra as
bordas afiadas dos
microorganismos.

Útil:

Amostras frescas
Movimentos de espécimes
não corados.
Organismos que coram
mal
Visualizar flagelos
bacterianos e bactérias
espirilares
O microscópio de fluorescência.

Usado para detectar substâncias com

autofluorescência ou substâncias
marcadas com fluorocromos
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO

O microscópio eletrônico tornou possível a resolução de

detalhes celulares no nível molecular e permitiu aos
cientistas observar as estruturas detalhadas das
células procarióticas e eucarióticas.

No campo da virologia, tem sido um instrumento muito

valioso, pois permitiu a observação e identificação de
vírus.

Este microscópio usa um fluxo de elétrons em vez de

raios de luz para produzir a imagem.

Amplie imagens até um milhão de vezes.

DE VARREDURA
COLORAÇÕES

Um corante biológico é uma molécula capaz de se ligar

a uma estrutura celular e dar-lhe cor.

Os corantes também são utilizados na constituição de

meios de cultura, como indicadores ou como
inibidores.
Objetivos de coloração:

 Demostrar microorganismos e algumas outras células.

 Revelar características morfológicas e estruturas
microbianas.
 Diferenciar os microrganismos de acordo com o seu
comportamento de tingimento.
Corantes ácidos: sais com o ânion colorido e a base incolora.
Eles têm afinidade por substâncias básicas, especialmente pelo
colágeno da matriz extracelular. O corante é depositado fora da célula,
de modo que a célula incolor é vista contra um fundo colorido. Por
exemplo, nigrosina, tinta chinesa, fucsina ácida.
 
Corantes básicos: sais onde a base fornece a cor, enquanto a
parte ácida é incolor, são corantes catiônicos. Eles têm afinidade por
substâncias ácidas no tecido e a célula fica manchada. Os mais
utilizados são: cristal violeta, fucsina básica, safranina.

 
Neutros: Tanto o cátion quanto o ânion têm poder de coloração, por
exemplo, eosinato de azul de metileno.
Tipos de coloração:

Impregnação: Precipitação de uma solução de sais metálicos na

superfície da bactéria. Por exemplo, coloração prateada para
espiroquetas.

Coloração simples: Um corante básico é usado. Permite

observar a morfologia das bactérias.

Coloração negativa: Usa um corante ácido. É usado para a

observação de cápsulas.

Coloração diferencial: Mais de uma solução de coloração é

usada, a fim de estabelecer diferenças entre as bactérias
Coloração de Gram: Esta é uma das colorações
mais utilizadas em Bacteriologia, pois permite
que as bactérias sejam divididas em dois
grandes grupos: Gram positivas e Gram
negativas.

Essa resposta à coloração de Gram é

condicionada pela diferente composição
química das paredes dessas bactérias.
(Gram positivos possuem uma alta % de
peptidoglicanos, enquanto os Gram negativos
possuem uma baixa % deste composto e
possuem lipídios e polissacarídeos).
 Coloração de Gram
Pasos de la Tinción Estado de las bacterias

Passo 1:- Fixação de A forma da célula é distorcida e

bactérias pelo calor diminui de tamanho

Passo2:- Adição do primeiro Todas as células se coram de azul

corante. cristal violeta arroxeado.
Coloração Básica (1min)

Passo 3:- Lave com água Todas as células permanecem

corrente. Adição de mordente. azul-arroxeadas.
Iodo (1 min)

Passo 4:- Adição de álcool As bactérias gram-positivas

+ - - permanecem azul-arroxeadas e
+ (1min)
+ + as bactérias gram-negativas são
- descoloridas.

- Passo 5:- Adição do segundo As bactérias Gram-positivas

+ - permanecem azul-púrpura e as
+ corante. Safranina. Corante ácido
+ - + (1min) bactérias Gram-negativas coram-
se em rosa.
 Coloração de Gram. Fundamentos.
- Primeiro corante (cristal violeta): básico, em contacto com bactérias
carregadas negativamente reage colorindo-as.

- - Solução Mordente (Iodo de Gram): fixa os corantes e aumenta a

afinidade entre o corante e a bactéria.

- - Agente clareador (álcool-acetona): solvente orgânico utilizado como

lavagem para remover o corante não fixado.

- - Corante de contraste (safranina): corante básico com cor diferente do

primeiro corante.
- As bactérias Gram (+) são coradas em roxo pelo cristal violeta e retêm a
coloração por sua espessa camada de peptidoglicanos. As bactérias Gram (-)
perderão sua coloração violeta de cristal inicial devido à sua fina camada de
peptidoglicanos e se corarão de vermelho devido à safranina.
Clostridium tetani Escherichia coli

Gram + Gram -
 Tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR)
A coloração de Ziehl-Neelsen (BAAR) é uma técnica de coloração diferencial, que se
baseia no fato de que as paredes celulares de certos parasitas e bactérias contêm
ácidos graxos (por exemplo, ácido micólico) que lhes conferem a propriedade de
resistir à descoloração com álcool-ácido , após coloração com corantes básicos. Por
esta razão, eles são chamados de bacilos álcool-ácido resistentes ou BAAR.

Micobactérias como Mycobacterium tuberculosis e M. leprae, Corynebacterium

diphtheriae e parasitas coccidianos como Cryptosporidium são caracterizadas por suas
propriedades ácido-álcool.
A coloração foi descrita pela primeira vez por dois médicos alemães, Franz Ziehl (1859 -
1926), bacteriologista, e Friedrich Neelsen (1854 - 1894), patologista.

Mycobacterium tuberculosis
 Coloración de Ziehl-Neelsen
1. Cobrir o esfregaço com carbol fucsina
2. É aquecido até emitir vapores
3. Descolora com álcool-ácido (ácido clorídrico a 3%
em etanol)
4. Aplicar corante de contraste (azul de metileno ou
verde malaquita)

 Microrganismos álcool-ácido resistentes (retêm a

cor vermelha do primeiro corante)
 Microrganismos não álcool-ácido resistentes
(pegue a cor do corante de contraste)
 Outras
Colorações
Colorações negativas: São utilizadas para a observação
de estruturas bacterianas difíceis de serem coradas com
outros métodos.
Baseia-se em destacar as células não coradas em um
fundo manchado; para os quais tinta chinesa ou
corantes ácidos são usados.

Colorações para demonstrar estruturas de

microrganismos (cápsulas, flagelos, esporos, grânulos
metacromáticos, núcleo)