AULA 6 – MÉTODOS DE

VISUALIZAÇÃO E COLORAÇÃO
N A P R Á T I C A L A B O R AT O R I A L

Profa. MSc. Bruna Karoline Lima Piazera

Métodos de visualização e coloração na prática
laboratorial

1. Coloração de Gram

2. Coloração de Ziehl-Neelsen

3. Coloração de Albert-Laybourn

4. Método de Fontana-Tribondeau
Coloração de Gram
 Coloração de ZIEHL-NEELSEN

• É utilizada para bactérias que não coram muito bem pela coloração
de Gram

• Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez

coradas vão resistir fortemente à descoloração, mesmo
por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto.
Coloração de ZIEHL-NEELSEN
As bactérias que possuem esta propriedade
dizemos que são ácido-álcool resistentes, (BAAR)
(géneros Mycobacterium e Nocardia).

Esta característica é devida ao elevado teor

de lipídeos estruturais (ex. ácido micólico)
na parede celular, que provoca uma grande
hidrofobicidade, dificultando a ação dos mordentes
e diferenciadores de corantes aquosos.

Mordente é uma substância associada ao tingimento com a

função específica de manter a durabilidade da cor, conferindo
maior resistência às lavagens e exposição ao sol.
 Mycobacterium
Mycobacterium ou micobactéria possui formato bacilares, são aeróbicas obrigatórias, imóveis e
altamente patogênicas, que causam diversas doenças, como: lepra, tuberculose e infeções por
micobactérias não tuberculosas.

Tuberculose
Lepra
 Princípio da técnica - ZIEHL-NEELSEN
• As micobactérias apresentam grande quantidade de lipídeos em suas
paredes celulares.
• Quando tratadas pelo corante Fucsina Fenicada, coram-se de vermelho e
persistem ao descoramento subsequente por uma solução de Álcool-ácido
forte (diferenciador).
• Por esse motivo são conhecidas como Bacilos Álcool-Ácido Resistentes
(BAAR).
• As outras bactérias, que não possuem tais paredes celulares ricas em lipídeos,
têm a sua coloração pela Fucsina descorada pela solução de Álcool-ácido.
 Amostras utilizadas - ZIEHL-NEELSEN
AMOSTRAS:
• Esfregaços feitos a partir de colônias bacterianas.
• Esfregaços de secreções das mais diversas partes do organismo.
• Esfregaços do sedimento urinário.

Obs: Toda amostra biológica deve ser considerada como

potencialmente infectante.
 Coloração de ZIEHL-NEELSEN

CORANTES

Solução de Fucsina Fenicada a 0,5% ----------- 500 mL

Solução de Álcool-Ácido a 3 % -------------------- 500 mL

Solução de Azul de Metileno a 0,3 % ------------ 500 mL

 Coloração de ZIEHL-NEELSEN - Técnica
1. Fixar o esfregaço (no calor);

2. Colocar as lâminas em suporte de coloração;

3. Cobrir as lâminas com Fucsina de Ziehl;

4. Aquecer as lâminas durante 5 minutos, permitindo a saída de vapores e evitando a fervura

da fucsina;

5. Após 5 minutos, escorrer e lavar as lâminas delicadamente com água;

6. Descorar as lâminas com solução de álcool ácido até que ela fique completamente clara;
 Coloração de ZIEHL-NEELSEN - Técnica
7. Lavar as lâminas com água corrente;

8. Corar com Azul de Metileno por 1 minuto;

9. Lavar em água corrente e secar.

 Coloração de ZIEHL-NEELSEN

RESULTADO ESPERADO
As bactérias ácido-álcool resistentes apresentam cor rosa a
avermelhada (ex: tuberculose).

As demais bactérias (não álcool-ácido resistentes), elementos

celulares e detritos, coram-se em azul pela solução de azul de
metileno
Coloração de ZIEHL-NEELSEN
 Técnica Albert Laybourn
Inicialmente foi sugerida por Henry Albert, em 1920, e
modificada por Ross Laybourn, em 1924

• Técnica utilizada para a observação de Cianobactérias

• Indicação: auxilia no diagnóstico da difteria

Seu diagnóstico é geralmente
clínico, mas a pesquisa de bacilos
metacromáticos pode ser um
importante auxiliar diagnóstico
 Corynebacterium diphtheriae
• É uma doença transmissível e causada pela Corynebacterium diphtheriae que atinge as
amígdalas, faringe, laringe, nariz e, ocasionalmente, outras partes do corpo, como pele e
mucosas.
• A presença de placas na cor branco-acinzentada nas amígdalas e partes próximas é o
principal sintoma da difteria.
• Dependendo do tamanho e de onde as placas aparecerem, a pessoa pode sentir dificuldade de
respirar.
• Em casos mais graves, porém raros, podem aparecer inchaços
no pescoço e gânglios linfáticos.

Transmissão: de pessoa para pessoa por meio das vias respiratórias

ou então através de contato físico

A doença pode ser prevenida com a vacinação.

 Baseia-se no fato de algumas bactérias apresentarem corpúsculos
citoplasmáticos localizados nas regiões polares que se coram pelo Lugol forte
(de cor marrom), se evidenciando, em contraste com o corpo bacilar, que se
cora em verde-azulado pela solução de Laybourn.
 Na coloração de Albert-Laybourn,
apresentam-se com granulações
metacromáticas (granulações
metacromáticas que se coram diferente do
restante da célula, principalmente nos
pólos).

Algumas corinebactérias podem atuar

como patógenos oportunistas, como a C.
minutissimum.
 Técnica Albert Laybourn
CORANTES

Solução de Lugol Forte

Solução de Albert-Laybourn
Iodo metálico............... 2,0 g
Azul de toluidina............... 0,15 g
Iodeto de potássio............... 3,0 g
Verde de malaquita............... 0,20 g
Água destilada................ 300 mL
Ácido acético glacial.................. 1 mL
Álcool 95°................. 2 mL
Água destilada............... 100 mL
Guardar em frasco âmbar ao abrigo da luz.
 Técnica Albert Laybourn - Técnica

A partir de esfregaços em lâminas homogêneo, delgado e fixado.

- Cobrir o esfregaço por 3 a 5 minutos, com a solução de Albert-Layborn.

- Escorrer (sem lavar).

- Cobrir com solução Lugol forte, por aproximadamente 2 minutos.

- Examinar a lâmina ao microscópio com a objetiva de imersão

 Método de Wirtz-Conklin
COLORAÇÃO DE ENDÓSPOROS

A esporulação, é o processo pelo qual alguns gêneros de bactérias formam

esporos. Ela ocorre quando as condições ambientais são adversas para o
crescimento dessas bactérias. De maneira geral, isto ocorre quando há falta de
nutrientes, como carbono ou nitrogênio.
 Método de Wirtz-Conklin
• Os esporos apresentam-se sob a forma de corpúsculos esféricos ou ovoides, livres ou no
interior da bactéria.

• Formam-se pela invaginarão de uma dupla camada de membrana celular, que se fecha para
envolver um cromossomo e uma pequena quantidade de citoplasma, garantindo a
sobrevivência da espécie. Esta camada é responsável pela resistência à coloração e ao ataque
dos agentes físicos e químicos da esterilização e desinfecção.

• Por isso que pra se corar os esporos é necessário um tempo prolongado de exposição ao
corante (verde malaquita), associado ao aquecimento, o que permite o rompimento desta
barreira obtendo-se, então, o esporo corado em verde intenso.
Método de Wirtz-Conklin
 Método de Wirtz-Conklin
Também chamado de Coloração para esporos com verde malaquina

CORANTES
Solução A: Verde malaquita a 5%
Verde malaquita............... 2,5 g
Água destilada............... 50mL
Misturar e deixar em repouso durante uma noite para dissolver.
 Método de Wirtz-Conklin
CORANTES

Solução B: Safranina
B.1 Solução estoque
Safranina............... 50 g
Etanol 95%............... 2000mL B.2 Solução de trabalho
Solução estoque de Safranina (B.1)......... 300
mL
Água destilada............ 2700 mL
 Método de Wirtz-Conklin - Técnica
A partir de esfregaços em lâminas homogêneo, delgado e fixado
bactéria esporulada (ex: Bacillus)
- Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita.

- Aproximar da chama até que desprenda vapor, sem deixar que o corante ferva. Afastar do fogo e, após 1 a 2
minutos, repetir a operação por 3 a 4 vezes.

- Lavar suavemente com água, evitando o choque térmico, que poderá quebrar a lâmina.

- Adicionar à solução de safranina por 30 segundos, lavar e secar.

- Observar ao microscópio com objetiva de imersão.

Método de Wirtz-Conklin