Aula Prtica Microbiologia Clnica Biomedicina

Coloraes utilizadas para identificao bacteriana

Prof. Dr. Deivid Batisto

COLORAO DE GRAM
Essa tcnica de colorao muito utilizada na bacteriologia, permitindo a distino entre
bactrias Gram positivas e Gram negativas. O princpio da tcnica est baseado na diferena de
composio da parede bacteriana e na capacidade destas paredes em reterem os corantes utilizados.
A parede celular das bactrias Gram positivas formada por uma camada espessa de
peptideoglicano, enquanto nas Gram negativas formada por uma camada fina de peptideoglicano,
apresentando uma membrana externa de lipopolissacardeos e protenas.
Procedimento:
1) Preparar o esfregao em lmina de vidro
2) Cobrir o esfregao com soluo de Cristal Violeta por
1 minuto.
3) Remover o CV com gua destilada
4) Adicionar soluo de Lugol por um 1 minuto
5) Remover a soluo de Lugol com gua destilada
6) Descorar com etanol, gota a gota at que no se note a
remoo do corante.
7) Remover o etanol com gua destilada
8) Adicionar a Safranina (Fucsina) durante 30 segundos
9) Remover a Safranina com gua destilada
10) Secar a lmina
11) Colocar uma gota de leo de imerso sobre o esfregao e observar ao microscpio
COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN

Desenvolvida pelo bacteriologista Franz Ziehl e pelo patologista alemo Friedrich Carl
Adolf Neelsen, em 1882. Baseia-se na propriedade de poucos gneros bacterianos (Mycobacterium
e Nocardia) de resistirem ao descoramento com uma soluo de lcool-cido, aps tratamento pela
fucsina fenicada aquecida, permanecendo coradas de vermelho (BAAR- Bacilo-lcool-cidoResistentes), diferentemente das outras bactrias, que, por no possurem esta propriedade, tomam a
cor do corante de fundo, normalmente feito com azul de metileno ou cido pcrico saturado.
A lcool-cido-resistncia est relacionada existncia na parede celular destas bactrias de
lipdeos fortemente ligados (ex.: cido miclico), que provocam hidrofobicidade, dificultando a
penetrao de corantes aquosos, a ao dos mordentes e dos diferenciadores, o que no ocorre em
outros gneros bacterianos.

Procedimento:
1) Preparar o esfregao em lmina de vidro
2) Cobrir o esfregao com soluo de fucsina de Ziehl, deixar agir por 5 a 10 minutos,
aquecendo com chama branda (evitar a fervura), at desprendimento de vapores (essa etapa
pode ser realizada em banho-maria, todavia, o tempo de aquecimento dobra para at 20
minutos).
3) Lavar em gua corrente e descorar com soluo de lcool-cido clordrico a 1%.
4) Cobrir o esfregao com azul de metileno, por aproximadamente 30 segundos.
5) Lavar e deixar secar.
MTODO DE FONTANA-TRIBONDEAU
Desenvolvido em 1920, no um mtodo de colorao verdadeiro. Na realidade, trata-se de
uma tcnica de impregnao pela prata usada para auxiliar a visualizao de bactrias espiraladas,
as quais, geralmente, so muito finas e se coram de forma insuficiente pelo Gram (ex.: Treponema
pallidum e Leptospira interrogans). A partir desta tcnica, as espiroquetas aparecem em cor
marrom-escura ou negra, sobre um fundo amarelo-castanho ou marrom-claro.

Procedimento:

1) Preparar o esfregao em lmina de vidro

2) Secar o esfregao ao ar
3) Derramar sobre a lmina algumas gotas de Lquido de Ruge (soluo fixadora) e deixar agir
por 1 minuto
4) Lavar a lmina com gua destilada
5) Cobrir com tanino (soluo mordente), aquecendo a lmina at a emisso de vapores,
durante 1 minuto.
6) Lavar a lmina com gua destilada
7) Tratar com nitrato de prata amoniacal (soluo impregnadora), aquecendo ligeiramente a
lmina at a emisso de vapores, deixando agir por 30 segundos (a preparao toma a cor
marrom).
8) Lavar e secar ao ar.
9) As bactrias aparecem de cor marrom e o fundo da lmina amarelo.