COLORAÇÃO PELO MÉTODO DE GRAM

Prof. MSc. João Rafael de Assis

 INTRODUÇÃO
• A coloração é um dos passos mais importantes para a
identificação bacteriana. A finalidade é facilitar a observação
microscópica das bactérias e diferenciá-las quanto às suas
características morfotintoriais.

• A coloração de Gram é uma das mais importantes e rotineiras em

Microbiologia, É uma coloração composta e diferencial, pois
permite a diferenciação de bactérias em Gram positivas e Gram
negativas.
 Materiais e Método
• Lamina de vidro;

• Papel Filtro;

• Microscópio;
 Regentes: Cristal Violeta
 Este composto cora toda a célula em roxo-azulado intenso.
• Solução A:
 Cristal Violeta (90-95% de pureza) - 2 g
 Etanol 95% - 20 ml
• Solução B:
 Oxalato de amônio
 Água destilada - 80 mL

 Preparo da Solução de Trabalho:

 Misturar as soluções colocando-se a solução B sobre a A. Deixar em repouso por
24 horas, filtrando em seguida.
 Estocar em frasco âmbar.
 Reagentes: Solução de lugol
 O iodeto substitui o cloro do cristal violeta, formando um complexo
insolúvel em água.

 Preparo da solução de trabalho:

 Cristais de iodo (ou ressiblimado) - 1 g
 Iodeto de potássio - 2 g
 Água destilada - 300 mL
 Misturar e deixar em repouso até dissolução
 Descorante: etanol 95% - acetona
 A solução de etanol 95% - acetona atua como descorante.
 A descoloração ocorre apenas nas células de microrganismos Gram negativos.
 Alguns autores sugerem que o álcool altera a permeabilidade da membrana
externa dos organismos Gram negativos, devido à sua ação sobre a membrana
lipopolissacarídica, permitindo a retirada do complexo cristal violeta-iodeto da
célula.

 Preparo da solução descorante de etanol - acetona:

 Acetona - 10 mL
 Etanol 95% - 100 mL
 Safranina (contracorante)
• A safranina atua como contracorante tornando as células Gram
negativas coradas e visíveis.
• As células de microrganismos Gram positivos provenientes de
culturas velhas, lesadas por qualquer motivo ou mortas, também
podem ser coradas pela safranina.
• Pode se usar fucsina de Ziehl-Neelsen 1:10.
 Preparo do contracorante - Safranina O - Solução estoque:
 Safranina O - 2,5 mL
 Etanol 95% - 100 mL
 Solução de trabalho:
 Solução estoque de safranina O - 10 mL
 Água destilada - 90 mL
Mecanismos Explicativo
 Explicação da coloração de Gram
• O mecanismo da coloração de Gram se refere á composição da
parede celular, sendo que as Gram positivas possuem uma espessa
camada de peptideoglicano e as Gram negativas, uma fina camada
de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta
por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos.

• Espessura de peptideoglicano:
– ↓ menor é a espesssura, ↑ é a permeabilidade da parede
celular.
 Resumo da Técnica
Soluções em ordem de Gram positivas
aplicação
1- Cristal violeta – CV Células coradas em violeta
2- Solução de iodo (lugol) – I Formação do complexo CV-I no
interior das células, que
permanecem violetas
3- Álcool Desidratação das paredes
celulares, diminuição da
porosidade e da permeabilidade:
o complexo CV-I não pode sair das
células que permanecem violetas
4- Safranina As células não são afetadas,
permanecendo violetas
Gram negativas
Células coradas em violeta
Formação do complexo CV-I no
interior das células, que
permanecem violetas
Extração dos lipídios da parede
celular, aumentando a
porosidade: o complexo CV-I é
removido das células
As células tomam o corante,
tornando-se vermelhas
 PREPARO DO ESFREGAÇO
• Coloca-se no centro da lâmina, com a alça de platina estéril uma alçada do
material a ser examinado e com movimentos circulares espalhamos
cuidadosamente.

• Se o material estiver em meio sólido, colocamos previamente uma gota de

solução salina estéril com a alça de platina no centro da lâmina e sobre esta
uma alçada do material, misturamos e espalhamos.

• O esfregaço deve ser fixado pelo calor, passando a lâmina três a quatro vezes
pela chama do bico de Bunsen.

• O aquecimento fixa e mata as bactérias do esfregaço. Deixar a lâmina esfriar.

 Técnica
• Cobrir o esfregaço com cristal violeta durante 1 minuto, escorrer o corante e lavar rapidamente.

• Cobrir a preparação com lugol, durante 1 minuto. Lavar em água corrente.

• Diferenciar com álcool etílico a 95% até que não se desprenda mais corante (cerca de 30
segundos).

• Lavar e escorrer o excesso de água.

• Cobrir a lâmina com fucsina diluída durante 30 segundos, Lavar em água corrente, escorrer, secar
com papel de filtro e passar rapidamente na chama do bico de Bunsen para terminar a secagem.

• Examinar em microscópio ótico utilizando objetiva de imersão (100x), com o condensador alto e
o diafragma aberto.