Identificação de cocos Gram Positivos

e bacilos Gram negativos

 Meios de cultura

• Destinados para a reprodução, isolamento e

análise dos microorganismos de interesse
medico.
 Meio de cultura
• Compostos por
– Hidrolisados de proteínas: fonte de C e N
– Carboidratos:
– Tampões
– Enriquecimento
– Inibidores
– Indicadores de pH
– Ágar: agente solidificante
– Substratos para ação enzimática
 Meio de cultura não seletivos
• Crescimento:

– Ágar chocolate
– Ágar sangue
– Ágar Cled
– Ágar Mueller Hinton
 Meio de cultura seletivos
• Ágar Manitol
• Ágar Mac Conkey, EMB
• Ágar Salmomella Shigella
• Ágar Sabouraud
• Ágar Bile-Esculina
• Ágar Lowestein Jensen
 Caldos :

• Caldo tetrationato
• Caldo selenito
• Caldo triptona e SIM
• Caldo BHI
 Meios de cultura:
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO

Ágar Nutriente
Salina tamponada
Clary Blair
Meio Stuart
Água peptonada
Cultura das amostras clínicas:
Semeadura por esgotamento
Cultura das amostras clínicas:
Semeadura quantitativa
 TÉCNICA DE GRAM

• Identificação das características bacterianas

referente ‘a coloração da parede celular e sua
diferenciação em bactérias Gram positivas e
Gram negativas;

• Verificação da forma, arranjo e tamanho das

bactérias .
 Técnica de coloração de Gram
• Flambar rapidamente uma lâmina de
microscopia limpa, nos dois lados, “cortando”
lentamente a chama do bico de Bunsen;
• Flambar a alça de platina até o rubor e esfriá-
la.
• Tomar o tubo de cultura com a mão esquerda
e com os dedos mínimo e anelar da mão
direita remover a tampa do tubo;
• Flambar a boca do tubo de cultura;
 Técnica:
• Cobrir com cristal violeta e deixar agir por 1
minuto;
• Cobrir com solução de lugol por 1 minuto;
• Lavar com água tomando cuidado pra que o
jato não incida diretamente no material a
ser analisado.
• Descorar com álcool acetona;
 Técnica

• Lavar com água;

• Corar com fucsina fenicada por 30 segundos;

• Lavar com água, secar e observar em objetiva

de 100 x com óleo de imersão.
 Resultado:

• Bactéria Gram positiva – roxo escuro

• Bactéria Gram negativa – avermelhadas

(rosada)
 Princípio da técnica
• O cristal violeta cora tanto a parede celular
das bactérias Gram + quanto Gram -.

• O lugol tem ação de fixador, sendo absorvido

por ambas, formando assim o complexo cristal
violeta-iodo ( CV-I) corando a bactéria de roxo.
 Princípio da técnica

O álcool acetona funciona como um solvente

atuando na porção lipídica da parede celular
das bactérias Gram -, resultando numa
porosidade e permeabilidade aumentada,
extraindo desta forma o complexo CV-I,
descorando as células.
• O álcool acetona, desidratando a espessa
camada de peptideoglicano das bactérias
Gram +, provoca a contração dos poros,
retendo desta forma o CV-I, mantendo as
células coradas.

• A última etapa do processo é tratamento com

o corante fucsina que cora a parede celular
das Gram -, tornado-as avermelhadas ou rosa.
• Gram positiva
• Gram negativa
 IDENTIFICAÇÃO
ESTAFILOCOCOS/ESTREPTOCOCOS
Bacterioscopia

Cocos Gram + Cocos Gram +

Agrupados Cadeias

Catalase

Positiva Negativa

Estafilococos Estreptococos
 PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO:
Prova da catalase
• Utilização para diferenciação de
Staphilococcus e Streptococcus.

• Diferenciadora de famílias e não de gêneros:

• Algumas bactérias possuem a enzima catalase,

capaz de converter o peróxido de hidrogênio
em oxigênio e água.
 Prova da catalase

H2O2 catalase 2H2O + O2

 Prova da catalase

• Em uma lâmina, colocar duas amostras da

bactéria isolada.
• Pingar sobre a amostra uma gota de peróxido
de hidrogênio 3%
• Observar a produção da liberação de O2 com
a formação de bolhas.
• O teste é positivo para o Staphylococcus
 Prova da coagulase
• As coagulases são enzimas com ação
semelhante a protrombina
• Agem sobre o plasma sanguíneo
transformando fibrinogênio em fibrina com a
produção de coágulo.
• Podem ser encontradas em duas formas:
conjugada e livre.
 Prova da coagulase

• Atividade enzimática utilizada para

diferenciação entre os Staphylococcus

• Coagulase positiva para Staphylococcus aureus

 Verificação da coagulase livre

• A coagulase livre tem ação similar a trombina

e está presente em filtrados e cultivos. É
secretada extracelularmente e reage com uma
substância presente no plasma – CRF (fator de
reação com a coagulase) para formar um
complexo que reage com o fibrinogênio,
formando fibrina.
 Coagulase conjugada

• A maioria dos S. aureus possui uma coagulase

ligada na superfície da parede celular que
reage com o fibrinogênio plasmático causando
a coagulação
 Coagulase conjugada
• Traçar dois círculos com lápis de cera em uma
lâmina de vidro;
• Colocar duas gotas de água destilada ou solução
fisiológica estéril dentro de cada círculo;
• Com auxílio de um alça bacteriológica agregar a
colônia em estudo, homogeneizando
delicadamente em cada círculo;
• Colocar uma gota de plasma para a prova de
coagulase em um dos círculos;
 Coagulase conjugada

• No outro círculo, adicionar outra gota de água

destilada ou solução fisiológica estéril, como
controle;
• Homogeneizar com palito de madeira;
• Inclinar a lâmina delicadamente, para frente e
para trás;
• Observar presença de aglutinação.
Prova da Coagulase
 Classificação quanto ao grau de hemólise
dos estreptococos
• Total ou beta hemolíticas : positiva para
Streptococcus pyogenes. Forma um halo
branco ao redor da bactéria;
• Parcial ou alfa hemolíticas: positiva para
Streptococcus pneumoniae. Forma um halo
esverdeado ao redor da bactéria
• Não hemolíticas ou gama hemolíticas:
positiva para Streptococcus viridans ou
Enterococcus faecalis. Sem halo.
Alfa hemólise
Beta hemólise
Gama hemólise ( sem hemólise)
 BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS

Gram-Negativo

Bacilos Cocobacilos Cocos

Enterobactérias Haemophilus

Bacilos Bordetella

não fermentadores Brucella

Neisseria
Campylobacter
Moraxella
Helicobacter Kingella
Vibrio
 IDENTIFICAÇÃO DE
BACILOS GRAM-NEGATIVOS
 Meios de cultura
• Ágar sangue ou chocolate
• Ágar MacConkey meio seletivo
Inibidores: sais biliares e cristal violeta, inibem
o crescimento de Gram positivas
Lactose como único carboidrato
Lac+ colônias vermelhas ou “pink”
Lac- colônias incolores, transparentes
 Meios de cultura
• Ágar Eosina azul de metileno(EMB)
Presuntivo para Escherichia coli
Inibidores e indicadores de fermentação:
eosina e azul de metileno, inibem o
crescimento de Gram positivas
Fermentadores de lactose colônias verdes
Não fermentadoras colônias transparentes
LACTOSE POSITIVA E NEGATIVA
 IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DAS
ENTEROBACTÉRIAS
• Através dos testes bioquímicos temos
informações sobre:
A- que tipo de substrato a bactéria utiliza
B- que tipo de enzima a bactéria produz
C- qual produto do metabolismo da bactéria
D- se ela necessita de substâncias
especiais para o crescimento
Provas Bioquímicas associadas
• MIO- motilidade, indol e ornitina
• Meio EPM
• Produção de gás:
• Produção de H2S: .
• Hidrólise da uréia:
• Desaminação do triptofano:
Meio MILi
• Motilidade
• Descarboxilação da lisina:
• Produção do indol
RUGAI MODIFICADO ( IAL )
RUGAI MODIFICADO ( IAL )

Vermelho +

Verde garrafa +

Amarela +
Preto +
Azul +

Roxa +