1) Qual a finalidade das provas bioquímicas catalase, coagulase urease e

oxidase? Diferencie-as

 PROVA DA CATALASE

Catalase é a enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e

oxigênio, sendo utilizada para auxiliar na identificação de Staplhylococcus, Streptococcus,
Enterococcus, Listeria, Corynecaterium, Micrococcus,Bacillus e Moraxella catarrhalis.O
procedimento consiste em primeiramente colocar 01 gota de peróxido de hidrogênio (água
oxigenada) a 3% sobre uma lâmina;segundamente com fio bacteriológico, agregar a colônia em
estudo na gota de peróxido de hidrogênio.
Quando a presença imediata de bolhas (efervescência) à catalase positivo. Suspeita de
Micrococcus spp ou Staphylococcus spp.
Ausência de bolhas ou efervescência à catalase negativo. Temos suspeita de
Streptococcus spp ou Enterococcus spp.

 PROVA DE COAGULASE 

As bactérias do gênero Staphylococcus têm como característica a capacidade de

coagular o plasma. Os estafilococos coagulase (+) (Staphylococcus aureus) são os patógenos
mais encontrados em infecções humanas. Já estafilococos coagulase (-) representam um extenso
grupo de espécies.
- coagulase: proteína com atividade similar à protrombina (converte fibrinogênio em
fibrina = formação de um coágulo visível)
- encontrada em duas formas com diferentes propriedades: coagulase conjugada e
coagulase livre.

Coagulase conjugada (prova em lâmina)

Coagulase: unida à parede celular bacteriana. Quando as células bacterianas são

suspensas em plasma (fibrinogênio), formam-se cordões de fibrina entre elas causando
agrupamento sob a forma de grumos visíveis.

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 Procedimento

1. Traçar dois círculos com lápis de cera em uma lâmina de vidro;

2. Colocar duas gotas de água destilada ou solução fisiológica estéreis dentro de cada
círculo;
3. Com auxílio de um fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo, homogeneizar
delicadamente em cada círculo;
4. Colocar uma gota de plasma para prova de catalase em um dos círculos;
5. No outro círculo, adicionar outra gota de água destilada ou solução fisiológica
estéreis (controle);
6. Homogeneizar com palito de madeira, inclinar a lâmina delicadamente, para frente e
para trás e observar a presença de aglutinação.

Interpretação

Positiva: formação de precipitado branco e aglutinação dos microrganismos da

suspensão após 15 segundos no círculo que contém o plasma.
 
Negativa: ausência de aglutinação no círculo que contém o plasma.
Controle sem plasma: deverá ser leitoso e uniforme, sem presença de precipitado ou
aglutinação. 

Coagulase livre (prova em tubo)

Substância similar à trombina, presente em filtrados de cultivos. Secretada

extracelularmente, reage com uma substância presente no plasma (Fator de Reação com a
Coagulase (CRF)), para formar um complexo que reage com fibrinogênio, formando fibrina
(coágulos). Quando uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase é
preparada em tubo de ensaio, forma-se um coágulo visível após o período de incubação.

Procedimento

1. Usar fio bacteriológico

2. Suspender colônias em estudo em caldo BHI;
3. Colocar em estufa à 37oC até que turve (se necessário), acertar a turbidez até 0,5 de
MacFarland;

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 4. Em um tubo de ensaio estéril, colocar 0,5 mL de plasma reconstituído e 0,5 mL de
caldo BHI com crescimento bacteriano recém-turvado;5.incubar em estufa a 35oC por 4 horas;
5. Verificar se há presença de coágulo. Se não houver, incubar o tubo em temperatura
ambiente e repetir as leituras com 18 e 24 horas de incubação.

Interpretação
Positiva: presença de qualquer grau de coágulo. 
Negativa: ausência de coágulo

 PROVA DE OXIDASE 

O teste da oxidase é um teste-chave para diferenciar entre as famílias de

Pseudomonadaceae (Oxidase positiva) e Enterobacteriaceae (Oxidase negativa), e útil para
especificação e identificação de muitas outras bactérias, aquelas que têm de usar o oxigênio
como o aceitador de elétrons final em respiração aeróbica. A enzima citocromo oxidase está
envolvida com a redução do oxigênio no final da cadeia de transporte de elétrons.
Para executar a triagem dos BGN (Bacilos Gram Negativos) não fermentadores da
glicose recomenda-se a pesquisa da oxidase, visto que algumas bactérias utilizam este açúcar
pela via oxidativa. Convém rotineiramente se aplicar a pesquisa da oxidase principalmente aos
BGN lactose negativos.
Outro uso é no processo de identificação bioquímica de Neisseria, estas são
consideradas oxidase positivas. Quando no uso do produto Bactray, que é destinado a
identificação.

Procedimento 

1- Deixar que o frasco contendo as tiras adquira a temperatura ambiente antes de ser
aberto;
2-Trabalhar próximo à chama abrir o frasco e retirar uma tira, fechar imediatamente o
frasco e retornar a geladeira;
3-Com o auxílio de uma alça bacteriológica, transferir assepticamente uma ou duas
colônias da bactéria em análise e espalhar sobre a superfície da área reagente da tira.
4-Outra alternativa é pingar uma gota de solução salina 0,85% estéril na tira de oxidase.
Posteriormente, com o auxílio de uma alça bacteriológica, transferir assepticamente uma ou
duas colônias da bactéria em análise e espalhar sobre a superfície da área reagente da tira.

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 5-Observar o resultado em até 2 minutos, o desenvolvimento de uma coloração violeta
caracteriza a prova da oxidase positiva ou neutra negativa.

PROVA DE UREASE 

O objectivo desta prova é determinar a capacidade do microrganismo para desdobrar a

ureia através da enzima urease.
A urease é uma enzima produzida por alguns microrganismos, mas é especialmente
importante para identificar espécies de Proteus relativamente a bactérias entéricas lactose
negativas.
A urease é uma enzima hidrolítica que ataca a ligação entre o azoto e o carbono em
compostos como a ureia, formando o produto final alcalino, amónia, além de CO2 e H2O.
A presença de urease detecta-se quando o microrganismo cresce num meio com ureia
(meio de ureia de Christensen) que contém também o indicador de pH, vermelho de fenol.
Quando a ureia é desdobrada pela urease, a amónia acumula-se no meio tornando-o alcalino.
Este aumento de pH faz com que o indicador de pH passe de amarelo a rosa, sendo uma reacção
positiva para a presença de urease. A ausência da coloração rosa indica uma reacção negativa.
No entanto, basta que ocorra o aparecimento de uma zona do meio rosa para se
considerar a reacção positiva; apenas os microrganismos que produzem precocemente urease
têm capacidade para modificar a cor de todo o meio para rosa forte.

2) Comente sobre as principais técnicas de imunodiagnóstico empregadas na

medicina Veterinária. Citando a importância.

   
Soro-Aglutinação Rápida em Placa (SARP)

A técnica denominada de SARP é um teste sorológico simplificado, manuseado em uma

superfície de vidro, sendo uma lâmina simples ou uma placa exclusiva para o teste.
 Para a realização desse método homogeiniza-se na superfície de uma lâmina uma gota
de antígeno comercial e uma gota de amostra do soro humano ou animal, agitando suavemente
por pelo menos um minuto. Para leitura desse, são utilizadas lentes e a incidência de luzes, e/ou
apenas olho nu. Se existir por fim, anticorpos específicos denominados aglutininas no soro,
poderá se formar grumos ou ainda floculação, produzida pelo agrupamento antígeno-anticorpo.
Ao constatar esses grumos é confirmado que na amostra exista anticorpos específicos.
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 A formação desses grumos é intitulada aglutinação, fenômeno que ocorre sem grau
específico, favorecendo a marcação de tabelas comparativas, caso as concentrações existentes
de anticorpos sejam altas ou baixas. Todavia, se for confirmada uma alta concentração de
anticorpos na reação, poderá ocorrer a inibição da reação de aglutinação, sendo esse evento
conhecido como pro- zona. 

A técnica em questão é um método vulnerável, apresentando baixa especificidade,

sendo qualitativo. Esse teste é realizado apenas em populações suínas, devido à presença de
fenômenos como pro-zona. Geralmente esses testes auxiliam diagnóstico de doenças como,
leptospirose, febre suína, salmonelose.

Imunodifusão em Gel de Ágar (AGID)

A imunodifusão em gel de Agar é uma técnica acessível que se dá pela precipitação de

antígenos por anticorpos, oportunizando a observação dos mesmos na linha de precipitação do
complexo antígeno-anticorpo. A reação utilizada para essa técnica é a difusão dupla, em que o
antígeno e o anticorpo podem se locomover livres no meio semi-sólido como ágar/agarose. 

Para essa técnica que utiliza uma placa de petri ou uma lâmina aquecida de agarose, até
que se forme uma camada solidificada, entre 2 e 4 mm de espessura. Com a solidificação dessa
camada em gel realizam-se perfurações circulares formando cavidades, que medem 5 mm de
diâmetro com um espaçamento de 10mm entre eles. É comum que essa técnica seja explorada
com um sistema radial de perfurações, dispondo de uma cavidade centralizada onde é
acrescentado o antígeno comercial e outras cinco cavidades periféricas, onde inseridas as
amostras de soros para os testes; logo depois encuba - se em camada úmida por 48 até 72
horas.Devido sua solubilidade e massa molecular, os anticorpos existentes no soro e os
antígenos irão se dispor radialmente no gel de Agar, ao juntar reagentes amostras serão obtidas
ótimas concentrações ocorrendo enfim o complexo antigeno- anticorpo,o qual manifestara uma
linha de precipitação branca e opaca. Para a leitura do teste e visualização da precipitação,
utiliza-se um ponto de luz como material em fundo preto em uma sala escura.

Alguns exemplos de doença detectada por esse exame, a Anemia Infecciosa Eqüina,
sendo infecciosa e transmitida secundariamente por mosquito, o meio exato de controle da
doença é o exame laboratorial, no qual é utilizado 2,0 de soro do animal infectado, manter
congelado até chega em um laboratório pelas Mao de um médico veterinário, se caso o exame

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for positivo, isola-se o animal para cuidados específicos e o meio onde esse equino se encontrar
ficará interditado.

Hemaglutinação (HI)

A Técnica de Hemaglutinaçao consiste na avaliação de anticorpos que ao reagir com

antígenos induzem a aglutinação de hemácias. Por possuírem estruturas diferenciadas, alguns
microrganismos se ligam a receptores encontrados nas hemácias, executando o fenômeno de
hemaglutinação (HA).

A positividade deste teste ajuda a indicar qualificar os anticorpos. Os proveitos tirados

desse método são especificidade e sensibilidade, o que dá a esse resultado a exatidão semelhante
a testes modernos e caros. Utiliza-se esse método para detectar doenças como influenza,
reovirose e outras.

Os anticorpos do reagente ou amostras possuem especificidade pelo substrato, assim se

usa essa malicia para purificar as proteínas, nesse caso entra as técnicas de purificação que são
divididas em métodos de imunoprecipitação e cromatografia por afinidade. 

Imunoprecipitação

Na imunoprecipitação o anticorpo do reagente ou amostra liga-se a agarose mediado

pela proteína A ou pela biotina/estreptoavidina, ou seja, conecta-se o anticorpo com a proteína
A, e essa integração é adicionado ao lisado celular. Após precipitação e centrifugação as
amostras podem ser lavadas e analisadas. 

Cromatografia por Afinidade

Na cromatografia por afinidade os anticorpos do reagente ao se ligarem a um composto

selecionam esse composto especificamente. Para esse feito, o anticorpo se liga na fase
estacionaria e o lisado que carrega o antígeno passa. Essa coluna cromatográfica é lavada em

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seguida, e os componentes não ligados são eliminados. Dentre as cromatografias a de afinidade
é a que tem o mais alto poder de purificação. 

Enzime Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)

Esse teste é considerado de alta especificidade em diagnóstico humano ou veterinário. A

detecção de um antígeno imobilizado sobre uma fase sólida (micro-placa de poliestireno)
mediante anticorpos que direta ou indiretamente produzem uma reação cujo produto, por
exemplo, um colorante, é mensurado por um espectrofotômetro. Os resultados são interpre-
tados após a leitura realizada por este equipamento, com uma absorbância no comprimento de
onda que varia entre 340 e 650 nm (de acordo com o cromógeno utilizado). Esta absorbância
será proporcional à quantidade do antígeno ou do anticorpo específico presente na amostra
testada.

Dentre as variações da ELISA (ELISA indireto, ELISA de competição por anticorpo,

ELISA de competição por antígeno e ELISA sanduiche), apenas o ELISA indireto e ELISA de
competição por anticorpo visam a detecção e titulação do anticorpo . O ELISA indireto é o
método de ELISA mais utilizado. Ele consiste na sensibilização da micro-placa de poliestireno
com um determinado antígeno, e a seguir, adiciona-se as amostras de soro a serem testadas. É
realizado um processo de incubação e lavagem e, se houver anticorpos específicos no soro, eles
irão permanecer fixados ao antígeno. Após, adiciona-se um anti-anticorpo conjugado a uma
enzima, chamado simples- mente de conjugado. É realizada nova lavagem e adicionado o
substrato, que inicia uma reação em contato com a enzima resultando em mudança de
coloração. Desta forma, se houver anticorpos no soro, o conjugado irá se ligar, possibilitando a
mudança de coloração.
Por sua vez, no ELISA de competição, a amostra de soro a ser testada é incubada
previamente com o antígeno e, apenas depois, adicionada sobre a micro-placa. As micro-placas
deste método de ELISA são sensibilizadas com o anticorpo, e deste modo, se houver anticorpo
no soro testado, o antígeno não se ligará aos anticorpos sensibilizados na micro-placa. Após
realizar uma lavagem, este complexo antígeno-anticorpo formado inicialmente será descartado.
Posteriormente, ao se adicionar o conjugado, estes não encontrarão antígenos para se fixar e,
igual- mente, serão descartados em nova lavagem. Por isto, se o soro for positivo, o substrato
não encontrará enzima para reagir, e a coloração permanecerá inalterada. Se não houver
anticorpos no soro, o antígeno e posteriormente, o anti- corpo conjugado com a enzima irão
permancer na micro-placa, possibilitando alteração na coloração.

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 A técnica de ELISA é um método simples e prático, permitindo uma completa
automação do sistema, sendo possível testar grande número de amostras simultaneamente e com
o mínimo de pessoal. Os antígenos ou anticorpos marcados podem ser estabilizados, podendo
ser conservados por longo tempo. Além disto, é uma técnica rápida, com alta sensibilidade,
podendo assim ser utilizada para detecção de anticorpos no soro, leite e secreções, além de
poderem ser específicos para uma determinada classe de imunoblobulina (IgG, IgM, IgA ou
IgE). Esta técnica tem sido utilizada para Doença de Aujeszky, Brucelose, Peste Suína Clássica,
Pleuropneumonia, Disenteria Suína, Febre Aftosa, Gastrenterite Transmissível, Parvovirose,
PRRS, dentre outros. Devido a possibilidade de auto- mação, têm sido a técnica mais utilizada
na monitoria e diagnóstico de doenças de suínos e aves, tanto pelo serviço de defesa animal
quanto pela agroindústria.

Soroneutralização (SN)

O teste de soroneutralização, também chamado de vírus-neutralização, é utilizado para

detectar anticorpos que possuem capacidade de neutralizar a infectividade do vírus ou a
toxidade de um agente infeccioso. 
O teste, geralmente, utiliza soro, mas eventualmente pode utilizar outros fluidos
corporais que possuam anticorpos. Nessa prova sorológica, examina-se a amostra de soro frente
ao vírus ou toxina suspeita de causar a infecção ou lesão celular. Pode ser utilizada para
praticamente todas as infecções virais, sendo os seus resultados bastante confiáveis. 

O objetivo da prova não é apenas o diagnóstico, mas também epizootiológico, ou seja,

determinar a prevalência e distribuição de anticorpos contra um determinado agente. Pode ser
executada para obterem-se resultados qualitativos ou quantitativos. Como a neutralização de um
determinado vírus só ocorre por anticorpos específicos contra ele, essa técnica é altamente
específica para todos os vírus ou toxinas utilizadas.
Inicialmente, incuba-se o soro-teste (inativado) com uma quantidade fixa do vírus para
o qual se está pes- quisando anticorpos. 

O procedimento básico consiste em misturar diluições apropriadas de soro e vírus em

micro- placas de 96 orifícios, incubando-a em condições ideais de temperatura (37°C) e tempo
(1, 2, ou 4h). Após a incubação do vírus com a amostra de soro a ser testada, a mistura é
adicionada a cultivos celulares susceptíveis à replicação do vírus (ou ação da toxina). O cultivo
é então monitorado diariamente (durante 3 a 5 dias) para ver se há a produção de efeito
citopático. Se o soro possuía anticorpos, o vírus será neutralizado (opsonizado) e não produzirá

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dano as células. Se o soro não possuir anticorpos, o vírus permanecerá viável e causará
citopatologia nas células de cultivo.

Apresenta vantagens alta especificidade e sensibilidade, além de ter a capacidade de

determinar os títulos de anticorpos nas populações imunizadas ou desafiadas a campo. Contudo
os resultados são demorados e requer laboratório com estrutura para manipulação de cultivo
celular. Uma desvantagem que pode diminuir sua sensibilidade é quando sua utilização se dá
para a detecção de anticorpos contra vírus antigenicamente variáveis, como os vírus de genoma
RNA. Neste caso, a utilização de um vírus padrão diferente dos vírus que ocorrem no campo
pode levar a resultados falso negativos.

São exemplos de viroses em que se pode fazer o diagnóstico através de

soroneutralização a Doença de Aujeszky, Rinite Atrófica, Estomatite Vesicular, Gastrenterite
Transmissível, Rhcbiaiva, Doença de Teschen e Talfan, dentre outras.