CIÊNCIAS BIOMÉDICAS LABORATORIAIS

MICROBIOLOGIA CLINICO-LABORATORIAL

Protocolo nº 8 –ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE

COCOS GRAM POSITIVOS

INTRODUÇÃO
Os cocos Gram positivos são espécies bacterianas constituídas por células de forma arredondada
(cocos) e imóveis.
A família Micrococcaceae é constituída por vários géneros, sendo o género Staphylococcus o
mais importante em termos clínicos. Dele fazem parte espécies como o S. aureus, que é o
membro mais importante, podendo ser isolado da pele e de várias membranas mucosas do
organismo. O S. aureus pode ser responsável por várias infecções como, pneumonia,
intoxicação alimentar, sindroma do choque tóxico, endocardite e abcessos.
O S. epidermidis faz parte da flora normal da pele, podendo ser patogénico em situações de
compromisso imunológico do hospedeiro. O S. saprophyticus, normalmente é comensal,
podendo no entanto ser responsável por infecções do tracto urinário em mulheres jovens.
A família Streptococaceae é constituída pelo género Streptococcus. Os estreptococos são
classificados de acordo com a sua actividade hemolítica, propriedades imunológicas
(classificação serológica de Lancefield), e resistência a factores físicos e químicos. As espécies
consideradas classicamente significativas em termos clínicos, são o S. pyogenes (agente
etiológico de faringite estreptocócica, escarlatina, febre reumática e vários tipos de infecções de
pele), o S. agalactiae (meningite, sepsis puerperal) e o S. pneumoniae (pneumonia).
Os Streptococcus do grupo D segundo a classificação de Lancefield (actualmente classificados
como Enterococcus) são isolados como flora normal do tracto gastrointestinal.
Os S. viridans fazem parte da flora oral normal assim como da flora do tracto gastrointestinal e
urogenital.
A identificação das bactérias tem por base:

1- Características morfológicas e tinturiais

 2- Características culturais
3- Características bioquímicas
4- Estrutura antigénica

PROCEDIMENTO LABORATORIAL

Visualização do esfregaço corado pela técnica de Gram

Pesquisa de catalase:

Fundamento

Em aerobiose, as bactérias utilizam normalmente o oxigénio como aceitador terminal de

electrões pela via oxidativa directa (fosforilação oxidativa).
As flavoproteínas são auto-oxidáveis e os átomos de hidrogénio libertados fixam-se
directamente sobre o oxigénio molecular (O2), levando à formação de peróxido de hidrogénio
(H2O2) ou do ião superóxido. Estes acumulam-se nas células, sendo letais para as bactérias se
não forem imediatamente degradados pelas enzimas superóxido dismutase e/ou catálase
(hidroperoxidase):

-
2 O2 + 2H+ superóxido dismutase O2 + H2O2

H2O2 Catalase2 H2O + O2

As bactérias aerotolerantes têm a superóxido dismutase mas não têm catalase, enquanto as
bactérias facultativas têm ambas.

Técnica

a) Colocar 2 gotas de H2O2 fresca numa lâmina

b) Com uma ansa retirar uma colónia de uma caixa de Petri e tocar na água oxigenada.

c) Observar ou não a produção de O2 (bolhas de gás).

Leitura

Catalase (+)- efervescência (libertação de O2)

Catalase (-)- não há efervescência (não há libertação de O2)

Interpretação

Os estafilococos são catalase positivos enquanto que os estreptococos são catalase negativos.

Pesquisa de coagulase

Fundamento

A coagulase é um produto extracelular que tem a característica única de coagular vários plasmas
de mamíferos. A coagulase reage com um factor plasmático, formando a estafilotrombina que
converte o fibrinogénio em fibrina (que é insolúvel) e que cobre a célula, defendendo-a das
defesas do hospedeiro.
A determinação da actividade da coagulase é utilizada para distinguir entre espécies patogénicas
e não patogénicas embora ainda não esteja provado que haja correlação entre a coagulase e o
poder patogénico.

Técnica em tubo:
a) Num tubo de hemólise colocar cerca de 500 μl de plasma de coelho (ou humano).

b) Adicionar 3 0u 4 colónias puras de uma cultura.

c) Incubar 1 a 4 horas os tubos a 37ºC.

Leitura e Interpretação

NegativoNão se forma fibrina

Positivo +1 Coágulos pequenos desorganizados
Positivo +2 Coágulos pequenos organizados
Positivo +3 Coágulos grandes organizados
Positivo +4 Todo o conteúdo coagula e não se solta quando o tubo é invertido

Coagulase (+) - estafilococos patogénicos (ex. S. aureus)

Coagulase (-) - proceder à pesquisa de DNase

Técnica de aglutinação - coagulase

Seguir bula do reagente

Pesquisa de hemolisinas:

Fundamento
As hemolisinas são exotoxinas, que provocam a destruição dos glóbulos vermelhos do sangue,
podendo classificar-se o tipo de hemólise consoante o tipo de ataque que a bactéria faz aos
glóbulos vermelhos.

Técnica:

a) Inocular as estirpes a estudar em gelose de sangue, pelo método de estrias.

b) Incubar 24h/37ºC.

Leitura:

- Hemólise β(hemólise total): halo claro e transparente à volta da colónia.

- Hemólise α(hemólise parcial): zona verde acastanhada à volta da colónia.

- Hemólise (ausência de hemólise).

Testes de sensibilidade aos antibióticos

1) Teste de sensibilidade à bacitracina (B):

Técnica:

a) Inocular uma placa de gelose sangue com estreptococos.

b) Colocar um disco impregnado com bacitracina no centro.

c) Incubar 24h/37ºC.

Leitura:

O aparecimento de uma zona de inibição à volta do disco de bacitracina, quer dizer que a
bactéria lhe é sensível, permitindo desta forma identificar os estreptococos do grupo A. Todos
os outros estreptococos são resistentes à bacitracina (Tabela 2).

2) Teste de sensibilidade à optoquina:

Técnica:

a) Inocular uma placa de gelose sangue com estreptococos.

b) Colocar um disco impregnado com optoquina no centro.

c) Incubar 24h/37ºC.

Leitura:
O aparecimento de uma zona de inibição igual ou superior 14 mm para um disco de 6 mm à
volta do disco de optoquina, quer dizer que a bactéria lhe é sensível, permitindo desta forma
identificar os strepcococcus pneumoniae.

Teste de aglutinação com látex (streptex)

Seguir bula de reagente

Anote os resultados dos testes de identificação para o género Staphylococcus:

Número da amostra __________
Gram_________
Teste da Catalase _____
Hemólise ______
Actividade da coagulase _____

Anote os resultados dos testes de identificação para o género Streptococcus:

Número da amostra __________

Gram_________
Teste da Catalase _______

Padrão de hemólise ______

Sensibilidade à bacitracina __________

Sensibilidade à optoquina ___________

Streptex _____________