ESCOLA SENAI MARIO AMATO

Marcela de Almeida Augusto

ANÁLISE DE COLIFORMES TOTAIS E ESCHERICHIA COLI PELA TÉCNICA DE

SUBSTRATO ENZIMATICO

SÃO BERNARDO DO CAMPO

2023
 SUMÁRIO

1. Objetivo..................................................................................................................................1
2. Introdução Teórica..............................................................................................................1
3. Equipamentos, Materiais e Reagentes..........................................................................1
4. Procedimento.......................................................................................................................1
5. Resultados............................................................................................................................1
6. Discussão dos Resultados...............................................................................................2
7. Conclusão..............................................................................................................................2
8. Referências...........................................................................................................................2
9. Capacidades sociais, organizativas e metodológicas..............................................2
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1. Objetivo

Analisar o substrato enzimático nos efluentes coliformes totais e Escherichia Coli

pela técnica enzimática e comparar com a legislação.

2. Introdução Teórica

As bactérias do grupo coliformes totais são definidas como bacilos Gram

negativos, não formadores de esporos, capazes de crescer e fermentar a lactose na
temperatura de 35°C a 37°C, pelo período de 24/48 horas.
A Escherichia Coli e os coliformes termo tolerantes ou coliformes fecais são um
subgrupos dos coliformes totais que fermentam lactose em temperatura mais elevadas
(44,5°C). A Escherichia Coli é a única bactéria do grupo dos coliformes totais cuja
habitat é exclusivamente o trato intestinal de animais de sangue quente, por este motivo
é considerada um indicador biológico ideal de contaminação fecal.
Conforme Decreto 8468-76 da CETESB art. 19. VII - ausência de qualquer
substância em concentração potencialmente tóxicas a processos biológicos de
tratamento de esgotos.8468-
Nos efluentes industriais, a quantidade de sulfatos e coliformes totais e de origem fecal
são estabelecidos de acordo com os seguintes parâmetros: 
“Art. 11 - Nas águas de Classe 2 não poderão ser lançados efluentes, mesmo
tratados, que prejudiquem sua qualidade pela alteração dos seguintes parâmetros ou
valores: 
III - Número Mais Provável (NMP) de coliformes até 5.000 (cinco mil), sendo 1.000 (mil) 
o limite para os de origem fecal, em 100 ml (cem mililitros), para 80% (oitenta por cento)
de, pelo menos, 5 (cinco) amostras colhidas, num período de até 5 (cinco) semanas
consecutivas” (SÃO PAULO, 1976, p. 4); 
“Art. 19-A - Os efluentes de qualquer fonte poluidora somente poderão ser lançados em
sistema de esgotos, provido de tratamento com capacidade e de tipo adequados,
conforme previsto no § 4° deste artigo se obedecerem às seguintes condições: 
I) sulfato -1000 mg/l (mil miligramas por litro) ” (SÃO PAULO, 1976, p. 8).
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DECRETO N 8468-76 
A legislação brasileira determina que em águas para consumo humano estas
bactérias estejam ausentes.

GRUPO DOS COLIFORMES TOTAIS

ENTEROBACTER CITROBACTER KLEBSIELLA E. COLI

SUBGRUPO DOS COLIFORMES

FECAIS OU TERMOTOLERANTES

Coliformes totais e Escherichia Coli são microrganismos frequentemente encontrados

em águas contaminadas e são utilizados como indicadores da qualidade microbiológica
da água. Esses microrganismos podem ser responsáveis por doenças de veiculação
hídrica e representam um sério problema de saúde pública em diversas regiões.

- Princípio do método de substrato enzimático:

O método do substrato enzimático ou cromogênico é baseado nas atividades

enzimáticas especificas dos coliformes –β galactosidade e da Escherichia Coli - β
glucoronidase.
Os meios de cultura para esta análise possuem o substrato cromogênico ONPG (orto-
nitrofenil- β-D-glucoronídeo) para detecção de Escherichia Coli. A presença destas
substancias, após o período de incubação provocam uma mudança de cor no meio de
cultura.
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- Teste Colilert
O teste Colilert detecta e quantifica simultaneamente coliformes totais e Escherichia
coli, com resultados em 24 horas.

3. Equipamentos, Materiais e Reagentes

3.1Equipamentos:

Cabine de Segurança Biológica;

Seladora;
Incubadora;
Câmara escura Luz UV;

3.2Materiais:
 Frascos de Coleta de Amostra;
 Cartelas Plástica Alumizada Estéril;
 Caixa térmica.

3.2 Reagentes:
 Tubete Colilert;
 Álcool 70°C;
 Tiossulfato de Sódio 10% ;
 Flaconete de Meio de Cultura.
 Água (amostra de efluente).

4. Procedimento

4.1 Coleta da Amostra

4.1.1 Separou-se os frascos plásticos de coleta com boca larga, verificou-se que
havia 0,1mL de tiossulfato de sódio 10%;
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4.1.2 Verificou-se estavam esterilizados;

4.1.3 Aplicou-se álcool 70°C no local que coletou-se a amostra;
4.1.4 Deixou-se a água escorrer durante +/- 2 minutos;
4.1.5 Abriu-se o frasco e coletou-se a amostra, não deixou-se o frasco muito
cheio;
4.1.6 Fechou-se bem o frasco, e armazenou-se em caixa térmica em
temperatura entre 2°C a 8°C;
4.1.7 Realizou-se a coleta e a análise em menos de 24 horas.

4.2 Ensaios de Coliformes totais e Escherichia Coli.

4.2.1 Preparou-se a cabine de segurança biológica;
4.2.2 Utilizou-se as boas práticas de laboratório;
4.2.3 Transferiu-se assepticamente, 100mL de amostra para um frasco estéril;
4.2.4 Adicionou-se um flaconete de meio de cultura;
4.2.7 Fechou-se o frasco, e agitou-se até a dissolução.
4.2.8 Transferiu-se para uma cartela;
4.2.9 Selou-se na seladora a cartela;
4.2.10 Incubou se a 35+/-0,5°C por 24horas.
4.2.11 Retirou-se a amostra da incubadora;

4.3 Teste com Colilert

4.3.1 Preparou-se a cabine de segurança biológica;
4.3.2 Utilizou-se as boas práticas de laboratório;
4.3.3 Transferiu-se assepticamente, 100mL de amostra para um frasco estéril;
4.3.4 Adicionou-se um flaconete de meio de cultura;
4.3.6 Acrescentou-se um tubete de Colilert;
4.3.7 Fechou-se o frasco, e agitou-se até a dissolução.
4.3.8 Transferiu-se para uma cartela;
4.3.9 Selou-se na seladora a cartela;
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4.3.10 Incubou se a 35+/-0,5°C por 24horas.

4.3.11 Retirou-se a amostra da incubadora;

4.4 Câmara escura de Luz U

4.4.1 Colocou-se as duas cartelas na Câmara escura de Luz UV;
4.4.2 Verificou-se a presença de E. Coli.

5. Resultados

- Figura 1: Tubete Colilert, Amostra Efluente e Frasco;

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- Figura 2: Cartelas Plástica (Amostra de Efluente sem contaminação e Amostra

Efluente Contaminada).

- Figura 3: Amostras dentro da Câmara escura de Luz UV.

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- Figura 4: Tabela Quanti-Tray /2000.

6. Discussão dos Resultados

Após o período de incubação, as cartelas foram interpretadas, sendo considerado

positivo para a presença de coliformes totais quando a água localizada nas
cavidades da cartela apresentou coloração amarela. Para verificar a presença de E.
coli, a cartela foi submetida a lâmpada de luz ultravioleta, e as cavidades amarelas
que apresentaram coloração azul fluorescente indicam a presença de E. coli.
Quando as cavidades permaneceram incolores, infere-se o resultado negativo para
a presença de bactérias do grupo coliforme. O número de poços positivos é
convertido em Número Mais Provável (NMP), por meio de uma tabela de conversão
que fornece contagens desde 25.3 a > 2.419 NMP/100 mL.

7. Conclusão

Após a análise microbiológica das amostras de água constatou-se que a amostra

sem tratamento não estava condizente com os parâmetros bacteriológicos exigidos
pelo Ministério da Saúde. Além disso, detectou a presença positiva de E. coli, um
determinante indicador de contaminação fecal, qual pode sinalizar a presença de
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vários outros microrganismos patogênicos. Sendo assim, compreender a origem da

poluição fecal é fundamental para a avaliação dos riscos associados à saúde, bem
como para executar as ações necessárias para a correção do problema, enquanto
ele ainda subsistir. Conforme a tabela de NMP a amostra apresentou um resultado
>2.419NMP/100mL.
Enquanto a amostra tratada, não apresentou coloração Azul Fluorescente em
Câmara de Luz Escura UV, determina que não há presença de E.Coli.

8. Referências

https://www.idexx.com.br/pt-br/water/water-products-services/quanti-tray-system/

https://www.promatecambiental.com.br/nossos-ensaios/coliformes-totais-e-escherichia-
coli/

Semina: Ciências Biológicas e da Saúde, Londrina, v. 40, n. 2, p. 129-140, jul./dez.

2019

Ministério da Saúde (BR). Secretaria de Vigilância em Saúde. Coordenação-Geral de

Vigilância em Saúde Ambiental. Portaria MS nº 2.914, de 12 de dezembro de 2011
Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para
consumo humano e seu padrão de potabilidade. Brasília; 2011