Universidade Federal de Viçosa - UFV

Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas

Departamento de Tecnologia de Alimentos
Prof. Wilmer Edgard Luera Pena

AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA BACTERICIDA DE SANITIZANTES QUÍMICOS:

TESTE DA SUSPENSÃO

Autores:
Antônio Augusto Fernandes Neto - 96589
Estefânia Cláudia Caldeira - 96620
Juliana Cristina da Mata Castro Freitas Pereira - 96393

Março de 2022
 Resumo

A garantia da segurança e qualidade dos alimentos está diretamente

relacionada ao controle sanitário dos alimentos dentro da indústria, sendo
necessário a adesão de procedimentos de higienização eficientes que tem como
objetivo reduzir a quantidade de microrganismos diversos nas superfícies de
equipamentos, utensílios e instalações. Para isso, conhecer o princípio ativo de
agentes químicos sanitizantes não é suficiente. É necessário a realização de testes
microbiológicos definidos pela Association of Official Analitycal Chemists – AOAC,
como o teste de suspensão. Nesse sentido, foram feitos análises em culturas de
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Salmonella spp. com os sanitizantes
hipoclorito de sódio, iodo e dicloroisocianurato de sódio. Assim, o sanitizante
dicloroisocianurato de sódio apresentou melhor eficiência bactericida pois
apresentou redução decimal acima do que é recomendado, obtendo uma ação mais
severa.
Palavras-chaves: efeito bactericida; microrganismos; segurança; sanitizantes

1. Introdução

A utilização de sanitizantes químicos é de fundamental importância para as

indústrias, principalmente a indústria de alimentos no controle sanitário dos
alimentos, e tem por finalidade garantir a segurança e qualidade dos alimentos, para
prevenir problemas relacionados à saúde e perdas econômicas. Assim, a qualidade
microbiológica é um fator essencial dentro da indústria, sendo necessária a adesão
de procedimentos de higienização eficientes.
A RDC Nº 14, DE 28 DE FEVEREIRO DE 2007 define sanitizantes como um
agente/produto que reduz o número de bactérias a níveis seguros de acordo com as
normas de saúde e desinfetante é definido como um produto que mata todos os
microrganismos patogênicos mas não necessariamente todas as formas
microbianas esporuladas em objetos e superfícies inanimadas. Para o procedimento
de sanitização são utilizados agentes químicos e conhecer apenas o princípio ativo
não é suficiente para indicar a eficiência dos agentes sanitizantes. Há a
necessidade de avaliar a ação antimicrobiana por meio de testes microbiológicos. A
RDC Nº 14, DE 28 DE FEVEREIRO DE 2007, no anexo V, estabelece quais
microrganismos devem ser testados dependendo do tipo de uso dos sanitizantes.
Para tanto, em uso geral de agentes sanitizantes químicos é necessário avaliar a
atividade microbiana de Staphylococcus aureus e Salmonella choleraesuis e uso em
indústria alimentícia e afins é necessário avaliar atividade microbiana de Salmonella
choleraesuis, Eschericia coli e Staphylococcus aureus. Contudo, deve-se levar em
consideração alguns fatores para a realização destes testes como: tipo de
superfície, tipo de microbiota contaminante; concentração do produto, entre outros.
A Association of Official Analitycal Chemists – AOAC recomenda alguns
testes para determinar a atividade microbiana de agentes químicos sanitizantes,
dentre eles podemos citar: Teste da suspensão; Teste da diluição de uso; Teste
esporicida; Teste de capacidade e Teste do coeficiente fenólico. O Teste de
suspensão é utilizado para avaliar sanitizantes empregados em superfícies não
porosas, previamente limpas, que entram em contato com os alimentos. Serve para
avaliar a eficácia do sanitizante na redução de uma população microbiana em
suspensão, sob condições práticas de uso. O teste consiste em determinar a
redução decimal na população microbiana de Escherichia coli ATCC 11229 e de
Staphylococcus aureus ATCC 6538, levando em conta o tempo de exposição e a
concentração do sanitizante.
É considerado adequado aquele que assegurar redução decimal superior ou

igual a 5, ou seja, o que corresponde a uma redução de cinco ciclos logarítmicos ou

99,999% na população microbiana, após 30 segundos de exposição a 20°C.

“Redução Decimal: é a diferença entre o logaritmo decimal do total de

microrganismos na suspensão microbiana e o logaritmo decimal de sobreviventes

após o contato com a solução sanitizante.” A realização destes testes são

essenciais para que o produto químico possa ser registrado no Ministério da Saúde

e comercializado, de forma a gerenciar o risco à saúde.

 2. Objetivo

O objetivo da prática foi realizar o teste de Suspensão para avaliar a

eficiência bactericida de sanitizantes, além de calcular o valor de RD, isto é, as
reduções decimais posteriormente.

3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais
● Ágar e meio de cultura PCA;
● Alça de Drigalsky;
● Béqueres;
● Caldo BHI;
● Erlenmeyers;
● Frascos;
● Pipetas graduadas;
● Placas de petri;
● Tubos de ensaio;

● Suspensão de microorganismos:
○ Bacillus cereus;
○ Salmonella spp;
○ Staphylococcus aureus;

● Soluções neutralizantes:
○ Amônia quaternária → Lecitina de ovo a 2% ou
tensoativo Tween 80 a 2%
○ Solução neutralizante de 0,25% Na2S2O3 para soluções
sanitizantes à base de cloro e iodo;

● Soluções sanitizantes:
○ Cloro Residual total a partir de hipoclorito de sódio
solução de iodóforo - 100 mg/L;
○ Cloro Residual total a partir de dicloroisocianurato de
sódio - 100 mg/L;
 ○ Iodo Residual Total a partir de iodóforo - 25 mg/L.

3.2. Métodos

O Teste de Suspensão realizado teve sua metodologia baseada no teste de

suspensão oficial descrito pela já mencionada Association of Official Analitycal
Chemists – AOAC, o qual tem como objetivo avaliar a eficiência do sanitizante em
função do número de RD - reduções decimais - de Staphylococcus aureus ATCC
6528 e de E. coli ATCC 11229. Além disso, como também mencionada
anteriormente, a solução sanitizante é aprovada caso obtenha,no mínimo, 5 RD
(99,999%) da população do microrganismo teste em 30 segundos de contato a
20°C. A equação 1 abaixo demonstra como é realizado o cálculo do RD.

𝑁º 𝑅𝐷 = 𝑙𝑜𝑔 𝑁0− 𝑙𝑜𝑔 𝑁f (Equação 1)

Sendo assim, primeiramente, para determinar o número inicial, isto é, N0, as

culturas de Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Salmonella spp, que estavam
estocadas e congeladas, foram repicadas para serem inoculadas em um tubo com
caldo BHI para, posteriormente, ser agitado e incubado em uma temperatura de
35ºC por 24 horas. Esse procedimento tem a finalidade de ativar a cultura
microbiana para realização do teste.
Dessa forma, para cada cultura microbiana foram realizadas cinco diluições
seriadas de 1 mL para cinco frascos distintos de 100mL, com diluições 10-2 , 10-4 ,
10-6 , 10-7 e 10-8, de forma que os três primeiros possuíam 99 mL de solução
salina, enquanto os dois últimos apenas 9 mL. Logo, a partir das diluições 10-6 ,
10-7 e 10-8 foi feito o plaqueamento, em duplicata, de cada diluição e, em seguida,
foram incubadas a 35ºC por um período de 24 a 48 horas. Após esse período, foi
realizada a contagem das placas e enumeração das colônias para observar o
crescimento e assim, obter o número inicial de microrganismos para Staphylococcus
aureus, B. cereus e Salmonella.
Já para determinar o Nf, isto é, número de sobreviventes, foi retirada 1mL de
cada suspensão microbiana e este foi diluído em 99 mL de cada amostra de solução
sanitizante a ser testada. Após o tempo de contato definido de 30 segundos, foi
retirado 1mL de cada mistura e colocado em 9 mL da solução neutralizante, de
forma a obter uma diluição de 10-3. De forma similar, foi realizada a diluição 10-4,
de forma que ambas diluição das amostras foram plaqueadas em ágar PCA e, em
seguida, incubadas a 35ºC por um período de 24 a 48 horas. Após esse período, foi
realizada a contagem das placas e enumeração das colônias para observar o
crescimento e assim, obter o número final de microrganismos para Staphylococcus
aureus, B. cereus e Salmonella.

4. Resultados e Discussão

Feito o plaqueamento das diluições 10-6, 10-7 e 10-8 encontramos os dados

disponíveis na Tabela 1. Com isso foi possível realizar o cálculo do número inicial
de microrganismos (N0), utilizando a média das duplicatas.

Tabela 1: Dados da contagem inicial de microrganismos.

Microrganismos B. cereus Salmonella S. aureus

Diluições

10-6 >250 >250 >250

10-7 >250 >250 153 / 122

10-8 29 / 83 124 / 183 Sem crescimento

Logo, os valores de N0 obtidos a partir das diluições contendo entre 25 e 250

colônias foram:

B. cereus: N0 = 5,6 x 109 UFC/mL

Salmonella: N0 = 1,5 x 1010 UFC/mL
S. aureus: N0 = 1,4 x 109 UFC/mL

Dado os valores (N0), foi realizada a análise da ação bactericida de cada um

dos três sanitizantes estudados, obtivemos as diluições de 10-3 e 10-4 para todos.
Os resultados encontrados após a ação sanitizante do Cloro a partir de hipoclorito
de sódio estão na Tabela 2, a seguir.

Tabela 2: Ação sanitizante do hipoclorito de sódio (100 mg/L).

Microrganismos B. cereus Salmonella S. aureus

Diluições

10-3 187/193 >250 >250

10-4 77/49 198/174 121/158

Assim, calculamos o número de microrganismos sobreviventes (Nf) após a

ação do hipoclorito de sódio, de forma análoga ao cálculo de N0.

B. cereus: N0 = 6,3 x 105 UFC/mL

Salmonella: N0 = 1,9 x 106 UFC/mL
S. aureus: N0 = 1,4 x 106 UFC/mL

Após a análise da ação sanitizante do iodo a partir de iodóforo, obtivemos os

resultados da Tabela 3, a seguir.

Tabela 3: Ação sanitizante do iodo (25 mg/L).

Microrganismos B. cereus Salmonella S. aureus

Diluições

10-3 >250 >250 >250

10-4 130 / 156 138 / 158 128 / 135

Calculado o valor de Nf,após a ação do iodóforo, obtivemos:

B. cereus: N0 = 1,4 x 106 UFC/mL
Salmonella: N0 = 1,5 x 106 UFC/mL
S. aureus: N0 = 1,3 x 106 UFC/mL

Após a análise da ação sanitizante do Cloro a partir de dicloroisocianurato de sódio ,

obtivemos os resultados da Tabela 4, a seguir.

Tabela 4: Ação sanitizante do dicloroisocianurato de sódio (100 mg/L)

Microrganismos B. cereus Salmonella S. aureus

Diluições

10-3 37 /28 0/2 22 / 24

10-4 Sem crescimento Sem crescimento 7/4

Calculado o valor de Nf, após a ação do dicloroisocianurato de sódio, obtivemos:

B. cereus: N0 = 3,3 x 104 UFC/mL

Salmonella: N0 = 1,0 x 103 UFC/mL
S. aureus: N0 = 2,3 x 104 UFC/mL

Dados os resultados obtidos após a análise da ação de todos os sanitizantes,

utilizamos a equação 1 para obter o número de reduções decimais (RD) para cada
um. Os resultados estão disponíveis na Tabela 5, a seguir.
Tabela 5: Número de reduções decimais, provocadas por cada sanitizante.

Sanitizante RD RD RD Aprovado /
B. cereus Salmonella S. aureus Reprovado

Hipoclorito de 3,9 3,9 3,0 Reprovado

sódio

Iodo 3,6 4,0 3,0 Reprovado

dicloroIsocianur 5,2 7,2 4,7 Aprovado

ato de sódio

Sabemos que para que um sanitizante seja aprovado para uso é necessário
que ele provoque, no mínimo, 5 reduções decimais, ou seja, eliminando 99,999%
dos microrganismos durante um tempo de contato de 30 segundos.
Dito isso, concluímos que o hipoclorito de sódio como sanitizante não foi
efetivo para nenhum dos microrganismos estudados. O composto químico obteve
apenas 3,9, 3,9 e 3,0 para B. cereus, Salmonella e S. aureus respectivamente, o
que representa 99,9% de redução, tendo seu uso permitido apenas para sanitização
de superfícies que não entram em contato com alimentos. Observamos também que
o S. aureus foi mais resistente ao sanitizante do que os outros microrganismos o
que nos leva a pensar que pode ter ocorrido erro durante as análises pois, o
hipoclorito de sódio é um sanitizante amplamente usado dentro da indústria e fora
dela. Este composto é um forte oxidante capaz de danificar a membrana externa da
célula, alterando sua permeabilidade, o que causaria um estresse severo e
consequentemente morte celular.
O Iodo obteve 3,6, 4,0 e 3,0 reduções para B. cereus, Salmonella e S. aureus
respectivamente e foi reprovado por não atingir a quantidade mínima de reduções
que é 5. Podemos ver que pode ter ocorrido o mesmo erro citado para o hipoclorito
de sódio pois o iodóforo não apresentou o resultado esperado, visto que ele é
altamente eficiente devido ao seu alto poder de penetração na parede celular, que
leva a quebra das estruturas de proteínas.
 O dicloroisocianurato de sódio foi o único sanitizante estudado que foi
aprovado, apesar de ter obtido apenas 4,7 reduções para S. aureus. Pode ter
ocorrido o mesmo erro citado nos procedimentos acima, para reafirmar se não
ocorreu nenhum erro experimental durante as análises ou para concluir que esse
microrganismo não se tornou resistente a esse composto químico. Para os
microrganismos B. cereus e Salmonella houve reduções acima de 5, representando
99,999% de redução, o que é desejado para que um sanitizante seja aprovado.

5. Conclusão

Dada as análises realizadas em aula prática e seus devidos resultados, é

possível concluir que dos sanitizantes estudados, a melhor escolha para a
sanitização seria o dicloroisocianurato de sódio pois, o mesmo apresentou um
número de reduções decimais acima do recomendado, que é de 5 RD (99,999%)
assim, causando uma alta redução na população de microrganismos. Ao estudar a
aplicação de sanitizantes é necessário considerar os diversos fatores envolvidos e
devido a isso existem vários tipos de testes para serem realizados e descobrir qual
é o melhor composto a usar na situação desejada. O teste de suspensão microbiana
pode ser considerado um teste prático e capaz de fornecer resultados relevantes,
mas deve ser considerado antes de tudo, o tipo de superfície, resíduos presentes a
serem removidos e sua quantidade, temperatura e pH da solução dentre outros
fatores.

6. Referências Bibliográficas

BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Aprova. Resolução da Diretoria

Colegiada nº 14, de 28 de fevereiro de 2007. Aprova Regulamento Técnico para
Produtos com Ação Antimicrobiana, harmonizado no âmbito do Mercosul, e dá
outras providências. Disponível em:
https://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2007/rdc0014_28_02_2007.html.
Acesso 19 de mar. 2022.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Aprova Resolução da Diretoria
Colegiada nº 59, de 17 de dezembro de 2010. Aprova Regulamento técnico que
Dispõe sobre os procedimentos e requisitos técnicos. Disponível em:
https://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2010/res0059_17_12_2010.html. Acesso
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 DESCONHECIDO. Limpeza e Sanitização na Indústria de Alimentos. 2018.
Disponível em:
http://www.quiminac.com.br/site/limpeza-e-sanitizacao-na-industria-de-alimentos/.
Acesso em: 19 mar. 2022.

AOAC: ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. OFFICIAL

METHODS OF ANALYSIS OF AOAC INTERNATIONAL. 17th etd., AOAC International,
Arlington, 2000

Notas de aula - Wilmer Edgard - Universidade Federal de Viçosa - TAL 463 Higiene
na Indústria de Alimentos

DESCONHECIDO. Aprenda avaliar a eficácia do uso de sanitizantes na

indústria de alimentos. 2020. Disponível em:
https://confrebras.org.br/aprenda-avaliar-a-eficacia-do-uso-de-sanitizantes-na-indust
ria-de-alimentos/. Acesso em: 19 mar. 2022.