TÉCNICAS

MICROBIOLÓGICAS
EMPREGADAS NO CONTROLE DE QUALIDADE
1 - Contagem de microrganismos viáveis
totais

filtração por membrana

contagem em placa
tubos múltiplos.
 FARMACOPEIA

é necessário que as amostras sejam preparadas

levando-se em consideração a sua solubilidade.

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 FARMACOPEIA
PREPARO DA AMOSTRA:
Produtos solúveis em água:

dissolver ou diluir 10 g ou 10 mL da amostra em

frasco volumétrico de 100 mL, completando o
volume com solução-tampão cloreto de sódio
ou solução peptona pH 7,0; solução-tampão
fosfato pH 7,2; ou meio digesto de caseína-soja.

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 FARMACOPEIA
PREPARO DA AMOSTRA:
Produtos não oleosos insolúveis em água:
dissolver ou diluir 10 g ou 10 mL da amostra
em frasco volumétrico de 100 mL, completando o
volume com solução-tampão cloreto de sódio ou
solução peptona pH 7,0; solução-tampão fosfato
pH 7,2; ou meio digesto de caseína-soja. Utilizar
solução de polissorbato 80 a uma concentração
de 1 g.L –1 , para dIminuir a tensão superficial. Se
necessário, ajustar o pH entre 6,0 e 8,0. Para mais
diluições utilizar o mesmo diluente..

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 FARMACOPEIA
PREPARO DA AMOSTRA:
Produtos oleosos:
dissolver ou diluir 10 g ou 10 mL da amostra ou uma
mistura do produto a ser examinado com uma
quantidade de polissorbato 80 esterilizado, suficiente
para diminuir a tensão superficial do produto em frasco
volumétrico e completar volume de 100 mL com miristato
de isopropila esterilizado por filtração e aquecido a 40-
45 o C. Agitar o frasco rapidamente até total dissolução,
mantendo-o em banho-maria, se necessário, até formar
uma emulsão homogênea. Se for preciso realizar
diluições seriadas, utilizar o mesmo diluente.

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 FARMACOPEIA
PREPARO DA AMOSTRA:
Fluidos e sólidos em forma de aerossol:
transferir o produto de maneira asséptica para
o aparato de membrana filtrante. Utilizar o conteúdo
total ou um número determinado de doses indicado nas
embalagens testadas. Realizar a filtragem utilizando
solução-tampão cloreto de sódio ou solução peptona pH
7,0; solução-tampão fosfato pH 7,2; ou meio digesto de
caseína-soja..

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 FARMACOPEIA
PREPARO DA AMOSTRA:
Adesivos transdérmicos:
retirar a capa de proteção dos adesivos e colocar em
superfície esterilizada como placas de Petri com a parte
adesiva voltada para cima. Cobrir essa superfície com
material esterilizado como uma gaze estéril para que os
adesivos não grudem. Transferir os adesivos para um volume
adequado de solução-tampão cloreto de
sódio ou solução peptona pH 7,0; solução-tampão fosfato pH
7,2; ou meio digesto de caseína-soja em um recipiente maior,
contendo polissorbato 80 ou lecitina. Agitar vigorosamente a
preparação por, pelo menos, 30 minutos.

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 Análises microbiológicas
Método de filtração por membrana
membranas com no máximo 0,45 μm de porosidade,
câmara de fluxo laminar
equipamentos para filtração e membrana esterilizados
por autoclavagem
Diluição 1:10
lavar com 100 mL de diluente estéril
Duas membranas filtrantes
ágar caseína-soja,30- 35ºC, 4 dias - Aeróbios
ágar Saboraud-dextrose, 20-25ºC - Fungos e
Leveduras

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 Análises microbiológicas
Método de contagem em placa
Método Pour-Plate
1 mL amostra diluida
15 a 20 mL de ágar caseína-soja ou Saboraund-
dextrose liquefeito a 45 º C
Incubar as placas a 30-35 º C durante quatro dias.

Diluir a amostra para contagem menos de 300 UFC

Duplicata

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

Esquema de contagem de microrganismos em placa pelo método de pour plate.
Oliveira, 2011, Figura 15.1
 Análises microbiológicas
Método de contagem em placa
Método de espalhamento em Superfície
15 a 20 mL de ágar caseína-soja e ágar Saboraund-
dextrose liquefeito a 45 º C
solidificar em câmara de fluxo laminar ou em
incubadora
Inocular 100 μL da diluição da amostra preparada
espalhar com alça de Drigalski até obter
espalhamento uniforme

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

Esquema para contagem de microrganismos em placa pelo
método de espalhamento em superfície.
Oliveira, 2011, Figura 15.2
 Análises microbiológicas
Método de contagem em placa
Contagem de colônias
Usar contador de colônias com iluminação artificial
controlada, lupa apropriada e, quando possível,
contador registrador.
Somente as placas que apresentarem até 250
colônias para bactérias e 50 para fungos deverão
ser consideradas para registro dos resultados.
Calcular a média aritmética
Calcular o número de microrganismos por g ou mL
Unidades Formadoras de Colônias (UFC)

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 Análises microbiológicas
Método dos tubos múltiplos
Método dos tubos múltiplos
Usar em ultimos casos, ou para baixa densidade de
MO
12 tubos contendo 9 mL de caldo de caseína-soja e
um tubo de Durhan invertido
Triplicata
Primeira diluição - 1mL da amostra
Segunda diluição - 1 mL da Primeira Diluição
Terceira diluição - 1 mL da Segunda Diluição
Ulmos tubos - 1mL do diluente (controle negativo)

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 90 ou 225 mL do diluente
10 ou 25 g
da amostra

Esquema de contagem
de microrganismos
Tubos 1 mL do diluente - pelo método do
contendo 9 mL controle negativo
Número Mais Provável
de caldo de
(NMP).
caseína-soja

Oliveira, 2011, Figura 15.3

 Análises microbiológicas
Método dos tubos múltiplos
Método dos tubos múltiplosI
Incubar 30-35 º C por 3 dias
verificar os tubos que apresentaram turvação
ou os que produziram gás
anotar o número e tubos positivos e
determinar o Número Mais Provável (NMP) de
microrganismos por g ou mL, utilizando a
tabela 1 da farmacopeia (5.5.3 - p02)

TÉCNICAS MICROBIOLOGICAS EMPREGADAS NO CQ

 Limites aceitáveis de
microrganismos em produtos
não estéreis
Preparações aquosas de uso oral, uso
tópico, inalatórios, preparação vaginal e produtos
transdérmicos, a contagem de bactérias aeróbias totais
não pode exceder 100 UFC/g ou mL e a contagem de
fungos, 10 UFC/g ou mL de amostra.

preparações de uso oral não aquosas e para uso retal, o

preconizado é que o número de bactérias seja inferior a
1000 UFC/g ou mL e o de fungos seja inferior a
100 UFC/g ou mL
 Limites aceitáveis de
microrganismos em produtos
não estéreis
preparações de uso oral que utilizam matérias-primas
naturais, para extratos secos, extratos fluidos ou tinturas,
esse limite é de 10 4 UFC.g –1 ou mL –1 para bactérias e
10 2 -10 3 UFC.g –1 ou mL –1 para fungos.

Para drogas vegetais que serão submetidas ao processo

de extração, esse limite sobe para 10 5 -10 7 UFC.g –1
para bactérias e 10 3 -10 4 UFC.g –1 para fungos,
dependendo do tipo de extração utilizada.
 Limites aceitáveis de
microrganismos em produtos
não estéreis

Para bases galênicas, o limite para bactérias é de

10 3 UFC.g –1 ou mL –1 e para fungos, 10 2 UFC.g –1
ou mL –1 de amostra.
Pesquisa de patógenos
Um dos testes fundamentais na avaliação da
qualidade microbiológica
Matéria-prima
Produto acabado
Métodos para dedectar presentes na FB 6 :
Escherichia coli, Salmonella sp., Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium e
Candida albicans.

Pesquisa de patógenos
 amostra preparada para a contagem de
Escherichia coli microrganismos em caldo caseína-soja
transferir 1 mL para 100 mL de caldo Mac Conkey
incubar a 42-44 º C por 24 a 48 horas
Transferir uma alçada desse meio para placas
contendo ágar Mac Conkey e incubar a 30-35 º C
por 18 a 72 horas
Vermelho = possivelmente E.coli
confirmada por testes bioquímicos adicionais (ágar
de eosina-cloreto de metiltionínio, ágar tríplice
açúcar-ferro, citrato de Simmons, indol, vermelho
de metila e teste de Voges-Proskauer).

Pesquisa de patógenos
 Para preparações orais e bases galênicas deve estar
Escherichia coli ausente em 1 g de amostra.
Extratos secos vegetais não devem apresentar esse
microrganismo em 10 g de produto.
Matérias-primas vegetais podem apresentar até 10
2 UFC.g –1 , dependendo do processo de extração
a que será submetido

Pesquisa de patógenos
 transferir 0,1 mL da amostra do caldo de caseína-
Salmonella
soja, usado para contagem de MO, para 10 mL de
caldo Rappaport-Vassiliadis
incubar a 30-35 º C por 18 a 24 horas
Transferir uma alçada desse meio para placas
contendo ágar xilose lisina desoxicolato
incubar a 30-35 º C por 18 a 48 horas.
Vermelho = possivelmente positivo
Confirmação com testes bioquímicos adicionais
(ágar tríplice açúcar-ferro, lisina-descarboxilase,
citrato de Simmons, urease e fermentação de
lactose).

Pesquisa de patógenos
Staphylococcus aureus
transferir 0,1 mL da amostra do caldo de caseína-
soja, usado para contagem de MO, para placas
contendo ágar sal manitol-vermelho de fenol
incubar a 30-35 ºC por 18 a 72 horas.
colônias amarelas com bordas fortes
confirmadas por testes bioquímicos adicionais
(coloração de Gram-positivo, coagulase e
desoxirribonuclease)

Pesquisa de patógenos
Pseudomonas aeruginosa
transferir 0,1 mL da amostra do caldo de caseína-
soja, usado para contagem de MO, para placas
contendo ágar cetrimida, utilizando o método de
estrias em superfície
incubar a 30-35 ºC por 18 a 72 horas.
colônias com diferentes morfologias -
Possivelmente positivo
Confirmar com testes bioquimicos (citocromo-­‐
oxidase, produção de fluoresceína, crescimento a
41 º C)

Pesquisa de patógenos
 separar duas frações da amostra preparada para
Clostridium contagem de microrganismos
aquecer uma delas a 80 º C por um período de 10
minutos e resfriar
transferir 10 mL de cada fração para 100 mL de
Caldo Reforçado para Clostridium
incubar em condições anaeróbicas a 30-35 º C por
48 horas
transferir uma alçada desse meio para placas
contendo ágar Columbia
incubar em condições anaeróbicas a 30-35 º C por
48 horas
confirmar com reação negativa para catalase

Pesquisa de patógenos
 o enriquecimento da amostra preparada para a
Candida albicans contagem de microrganismos em caldo Sabouraud-
dextrose por 3 a 5 dias
transferir uma alçada para placas contendo ágar
Saboraund-dextrose
incubar a 30-35 º C por 24 a 48 horas
colônias brancas = possivelmente positivo
confirmar com testes bioquímicos adicionais
(assimilação de açúcares, produção de tubo
germinativo, produção de fosfolipase e produção de
proteinase).

Pesquisa de patógenos