FACULDADE PITÁGORAS

Disciplina: Análises físico-químicas e microbiológicas

de alimentos
Professor(a): Dra. Tatiane Araújo

Técnicas para quantificação

de microrganismos em
alimentos
INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº
62, DE 26 DE AGOSTO DE 2003.
Oficializar os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas
para Controle de Produtos de Origem Animal e Água
RESOLUÇÃO - RDC Nº 12, DE 2 DE JANEIRO DE
2001
Art. 1º Aprovar o REGULAMENTO TÉCNICO SOBRE PADRÕES MICROBIOLÓGICOS PARA
ALIMENTOS

OBJETIVO : Estabelecer os Padrões Microbiológicos Sanitários para Alimentos

especificados no Anexo I e determinar os critérios para a Conclusão e Interpretação
dos Resultados das Análises Microbiológicas de Alimentos Destinados ao Consumo
Humano
 CRITÉRIOS PARA O ESTABELECIMENTO
DE PADRÕES MICROBIOLÓGICOS
SANITÁRIOS EM ALIMENTOS.

Os critérios para estabelecimento de padrão microbiológico podem ser considerados

isoladamente ou em conjunto conforme a seguir:
2.1.Caracterização dos microrganismos e ou suas toxinas considerados de interesse sanitário.
2.2.Classificação dos alimentos segundo o risco epidemiológico.
2.3.Métodos de análise que permitam a determinação dos microrganismos
2.4.Plano de Amostragem para a determinação do número e tamanho de unidades de
amostras a serem analisadas.
2.5.Normas e padrões de organismos internacionalmente reconhecidos, Codex Alimentarius
e outros organismos.
 DEFINIÇÕES
DTA: Doença Transmitida por Alimento causada pela ingestão de um alimento
contaminado por um agente infeccioso específico, ou pela toxina por ele
produzida, por meio da transmissão desse agente, ou de seu produto tóxico.

Amostra indicativa: é a amostra composta por um número de unidades amostrais

inferior ao estabelecido em plano amostral constante na legislação específica.

Amostra representativa: é a amostra constituída por um determinado número de

unidades amostrais estabelecido de acordo com o plano de amostragem.
Matéria-prima alimentar: toda substância de origem vegetal ou animal, em estado bruto, que
para ser utilizada como alimento precise sofrer tratamento e/ou transformação de natureza
física, química ou biológica.

Produto semi-elaborado: são aqueles produtos que serão submetidos a outras etapas de
processamento industrial que não impliquem em transformação de sua natureza.

Alimentos comercialmente estéreis: alimentos processados em embalagens herméticas,

estáveis à temperatura ambiente.

Unidade amostral: porção ou embalagem individual que se analisará, tomado de forma

totalmente aleatória de uma partida como parte da amostra geral.
Conceitos gerais
Lote: quantidade de alimento de mesma composição e
características físicas, químicas e sensoriais, produzidas e
manuseada numa mesma batelada, sob as mesmas
condições.
Amostra de lote: é uma fração do total produzido, retirada
ao acaso, para avaliar as condições do lote.
 Amostra indicativa x amostra
representativa
Amostra indicativa:
é a amostra composta por um número de unidades amostrais
inferior ao estabelecido em plano amostral constante na legislação
específica.

Amostra representativa:
é a amostra constituída por um determinado número de unidades
amostrais estabelecido de acordo com o plano de amostragem.

ICMSF: varia entre 5 e 60, de acordo com a categoria do risco

RDC 12: sempre igual a 5
Planos de amostragens
Desenvolvido com a finalidade de avaliar as condições de
qualidade de lotes e permitir um julgamento sobre a sua
aceitação ou rejeição
 Planos de amostragem
Plano de duas classes: classifica os lotes em aceitável e inaceitável, dependendo
dos resultados da análise das n unidades de amostra. São os mais aplicados no
caso de ensaios de presença/ausência, como em Salmonella, em que ausência é
aceitável e a presença em qualquer das n unidades de amostras é inaceitável.
Plano de três classes: classifica os lotes em três categorias: aceitável, qualidade
intermediaria mas aceitável e inaceitável. São recomendados para ensaios
qualitativos, para os quais o padrão não é ausência, mas sim, valores dentro de
uma faixa m e M.
 Parâmetros
n: é o numero de unidades de amostras a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote,
para serem analisadas individualmente. As n unidades de amostras constituem a amostras
representativa do lote.
m: é o padrão microbiológico estabelecido para um dado microrganismos, num dado
alimento. Em um plano de três classes esse valor separa um lote aceitável de um lote com
qualidade intermediária aceitável.
M: é um limite tolerável, acima do padrão, que pode ser atingido por algumas (c) unidades
de amostra, mas não pode ser ultrapassado por nenhuma. Em um plano de duas classes, M
separa o lote aceitável do inaceitável. Em um plano de três classes, separa o lote com
qualidade intermediária aceitável do lote inaceitável.
c: dentre as n unidades de amostras que constituem a amostra representativa do lote, c é o
numero máximo de unidades que podem ser aceitas com contagens acima do padrão m,
desde que não acima do limite M. Nos casos em que o padrão microbiológico é a ausência, c
é igual a zero e aplica-se o plano de duas classes.
 Limite m
Indica boas práticas
BPF – Boas Práticas de Fabricação
BPH – Boas Práticas de Higiene

Limite M
Indica práticas inadequadas
Fabricação, Higiene, Armazenamento, ...
Risco ao consumidor
Deterioração
 Legislação
Resolução RDC-12 – ANIVSA – MS – 02/02/2001
Exemplo: FRUTAS, PRODUTOS DE FRUTAS E SIMILARES

Tolerância Tolerância para Amostra

para Representativa  
GRUPO DE ALIMENTOS   MICRORGANISMO   Amostra
Indicativa n  c  m  M 

1 FRUTAS, PRODUTOS DE FRUTAS e SIMILARES  

a) morangos frescos e
Coliformes a 45oC/g   2x103   5  2  2 x 102 2x103  
similares, "in natura", inteiras,
selecionadas ou não.   Salmonella sp/25g   Aus   5  0  Aus   - 

b) frescas, "in natura",

preparadas ( descascadas ou Coliformes a 45oC/g   5x102   5  2  102   5x102  
selecionadas ou fracionadas)
sanificadas, refrigeradas ou
congeladas, para consumo Salmonella sp/25g   Aus   5  0  Aus   - 
direto.  
 Legislação
Resolução RDC-12 – ANIVSA – MS – 02/02/2001

Exemplo: GELADOS COMESTÍVEIS

Tolerância Tolerância para Amostra

para Representativa  
GRUPO DE ALIMENTOS   MICRORGANISMO   Amostra
Indicativa n  c  m  M 

21 GELADOS COMESTÍVEIS E PRODUTOS PARA O PREPARO DE GELADOS COMESTÍVEIS  

a) gelados comestíveis e
produtos especiais gelados a Coliformes a 45ºC/g   5x10   5  2  10   5x10  
base de leite e produtos lácteos
(sorvetes e picolés com ou sem
cobertura, sanduíche e bolo de Estaf.coag.positiva/g   5x102   5  2  102   5x102  
sorvete) e similares;
Preparados e concentrados para
o preparo de gelados
comestíveis  Salmonella sp/25g   Aus   5  0  Aus   - 
 Como preparar uma amostra?
-Preparo da 1ª diluição da unidade analítica
Diluentes utilizados:
a) Água peptonada 0.1 % ou Tampão fosfato pH 7,2 (Compedium –
Midura & Bryant, 2001)

b) Soluçao Ringer ¼ de concentraçao, água peptonada 0.1 % , água

salina peptonada, Tampão fosfato pH 7,2 ou Tampão fosfato
Cloreto de Magnésio (água de diluição fosfato Magnésio) (Standart
Methods for the Examination of Dairy Products - Davis & Hickey,
2004)
 COMO OBTER UMA DILUIÇÃO INICIAL 1:10
(10-1)
Adicionar m gramas ou mililitros da amostra para 9 x m mililitros do
diluente
Ex: 25g de amostra, adicionar 9x25 mL de diluente (225mL)

(10-1)
225 mL de água
25 gramas peptonada

15g de amostra, adicionar 9x15 mL de diluente (135mL)

(10-1)
15 gramas 135 mL de água
peptonada
 DILUIÇÃO DECIMAL SERIADA
O número de diluições decimais necessárias depende do nível de contaminação
esperado e deve ser tal, que permita, na contagem em placas, a obtenção de placas
com número de colônias entre 25 e 250 ou 15 a 150 na contagem de bolores e
leveduras.
Para obter a segunda diluição (10-2), retira-se 1 mL da primeira diluição para 9 mL de
diluente.
Para as diluições subseqüentes (10-3), realiza-se o mesmo procedimento, retirando
alíquotas de 1 mL da diluição anterior.
 Tipos de plaqueamento
- Spread plate: plaqueamento em superfície
-Pour plate: plaqueamento em profundidade
Contagem em placas

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Cálculo: numero de colônias na placa x diluição da amostra = numero de bactérias por mL

Ex: se forem contadas 32 colônias na diluição 1:10.000 = 320.000/mL
Atividade 2
3. Suponha que você tenha realizado análises microbiológicas de uma amostra
de 25 g de maionese pela técnica de plaqueamento Pour Plate. Os resultados
encontrados foram:
Diluições plaqueadas
Meio de cultura
10-4 10-5 10-6 10-7
na placa

VRBG 285/277 149/153 13/17 2/2

PCA 1023/1100 265/258 187/92 18/12
BDA 333/325 264/260 163/168 17/21
A partir dos resultados mostrados no quadro acima, calcule a contagem de mesófilos
aeróbios, fungos filamentosos e leveduras e de enterobactérias, expressando o
resultado em UFC/g. Complete o quadro abaixo com os resultados finais.
Micro-organismo Contagem (UFC/g)
Mesófilos aeróbios
Fungos filamentosos e leveduras
Enterobactérias
 CONTAGEM PADRÃO DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS
AERÓBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS VIÁVEIS

1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem padrão de microrganismos

mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis. Aplica-se a amostras de matérias-primas, água
e alimentos.
2. FUNDAMENTOS Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluições em ágar padrão
para contagem seguida de incubação em temperatura de 36 ± 1ºC por 48 horas.
3. REAGENTES E MATERIAIS : Agar padrão para contagem (PCA); Solução salina peptonada 0,1%.
4. Incubação: Incubar as placas invertidas a 36 ± 1°C por 48 horas.
Expressar o resultado em UFC/g ou mL / Placas que contenham entre 25 e 250 colônias;
 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS
1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de bolores e
leveduras em alimentos. Aplica-se a amostras de matérias-primas, alimentos e rações.
2. FUNDAMENTOS Baseia-se na verificação da capacidade desses microrganismos se
desenvolverem em meios de cultura com pH próximo a 3,5 e temperatura de incubação
de 25 ± 1ºC. A utilização de meios acidificados a pH 3,5 ± 0,1 promove seletivamente o
crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactérias presentes no alimento.
3. REAGENTES E MATERIAIS :Ágar batata glicose 2%; L(+) Ácido tartárico 10%; Solução
salina peptonada 0,1%.
4. Expressar o resultado em UFC/g ou mL / Leitura: Selecionar as placas que contenham
entre 15 e 150 colônias.
 CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de Staphylococcus
aureus. Aplica-se a amostras de matérias-primas e alimentos. Para os produtos destinados
ao comércio no MERCOSUL, a contagem final se referirá apenas a Staphylococcus coagulase
positiva.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras em ágar Baird-
Parker, cuja composição evidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presença
de 0,01 a 0,05% de telurito de potássio em combinação com 0,2 a 0,5 % de cloreto de lítio e
0,12 a 1,26% de glicina. O Staphylococcus aureus reduz anaeróbia e aerobiamente o telurito
de potássio, produzindo colônias negras. O ágar Baird-Parker suplementado com solução de
gema de ovo possibilita a verificação das atividades proteolítica e lipolítica do
Staphylococcus aureus , por meio do apareccimento de um halo de transparência e um de
precipitação ao redor da colônia, respectivamente.
 CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
2.2 Prova da coagulase: Baseia-se na comprovação da capacidade de coagular o
plasma de coelho pela ação da enzima coagulase produzida pelo microrganismo.
2.3 Provas complementares
2.3.1 Coloração de Gram: Baseia-se na verificação das características morfológicas
e tintoriais do microrganismo.
2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradação do DNA em
oligonucleotídeos pela ação da enzima DNAse produzida pelo microrganismo. A
reação é evidenciada pelo aparecimento de um halo de coloração rósea no ágar
azul de toluidina e de clarificação, quando utilizado o ágar para teste de DNAse
com verde de metila.
2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor
o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da
formação de borbulhas
 TESTE DE COAGULASE

TESTE DE TERMONUCLEASE

TESTE DE CATALASE
 CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES
TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS
1. OBJETIVOS E ALCANCE Estabelecer procedimento para a contagem de coliformes totais
e coliformes termotolerantes em alimentos. Aplica-se a amostras de matérias-primas,
alimentos e rações, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado for igual ou
superior a 100 UFC/g ou mL.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob
teste em ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das
colônias suspeitas. O ágar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua
composição sais biliares e cristal violeta, responsáveis pela inibição de microrganismos
Gram positivos e vermelho neutro, um indicador de pH que revela a fermentação da
lactose pelos microrganismos presentes. A adição de sobrecamada visa a prevenção do
crescimento e do espraiamento de colônias na superfície do ágar.
CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES
TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS

3. REAGENTES E MATERIAIS Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);

Caldo verde brilhante bile 2% lactose; Caldo EC; Solução salina peptonada 0,1%.
Para alimentos comercializados no MERCOSUL, os resultados de contagem de
coliformes totais se referem à determinação “contagem de coliformes a 35ºC” e
os resultados da contagem de coliformes termotolerantes correspondem à
determinação “coliformes a 45ºC”.
 Confirmativo para coliformes totais
Prova confirmativa para coliformes totais;
A confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação das
colônias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e posterior incubação a 36
± 1ºC. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose
presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua
composição bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante)
responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos.
 Confirmativo para coliformes termotolerantes
2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes:
A confirmação da presença de coliformes termotolerantes é feita por meio da
inoculação das colônias suspeitas em caldo EC e posterior incubação em
temperatura seletiva de 45 ± 0,2ºC, em banho-maria com agitação ou circulação
de água. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da
lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura
de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificação. A
seletividade é devido a presença de sais biliares responsáveis pela inibição de
microrganismos Gram positivos.