CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS

FACULDADE DE FARMÁCIA

Anna Caroline S. S. Zolinger

Anna Julia de Souza Pereira
Giovanna de Azevedo
Henrique de Paula Soares
Lucas Soares de Oliveira
Stefany França Silva

ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA

EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA

São Paulo, 2022

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Anna Caroline S. S. Zolinger

Anna Julia de Souza Pereira
Giovanna de Azevedo
Henrique de Paula Soares
Lucas Soares de Oliveira
Stefany França Silva

ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP), SEMEADURA

EM MEIOS SÓLIDOS E COLORAÇÃO DE GRAM EM ALIMENTOS E LEITURA

Relatório técnico apresentado como requisito

parcial para obtenção de aprovação na disciplina
Análise de Alimentos, na FMU.

Prof. Msc. Viviane Cristina Longuini de Menezes

São Paulo, 2022

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..............................................................................................3
2 DESENVOLVIMENTO.................................................................................. 4
2.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................... 4
2.2 METODOLOGIAS......................................................................................... 4
2.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS........................................................ 5
3 RESULTADOS.............................................................................................11
4 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES......................................................17
ANEXO........................................................................................................18
REFERÊNCIAS.......................................................................................... 20
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1 INTRODUÇÃO

As infecções alimentares segundo o Ministério da Saúde são doenças

consideradas problemas de saúde pública em todo o mundo, elas são
caracterizadas por produzirem sintomas como náuseas, vômitos, diarreia, febre e
anorexia e são transmitidas através da ingestão de alimentos ou água
contaminados.
A bactéria Escherichia coli apesar de fazer parte da microbiota natural do ser
humano, pode se tornar um potencial agente patogênico quando presente em
alimentos contaminados, causando infecções alimentares em seu hospedeiro. Uma
das formas de evitar a contaminação é através das boas práticas de produção e
manipulação de alimentos, assim como evitar o consumo de alimentos mal cozidos
ou água não tratada.
Outra bactéria que pode apresentar potencial infeccioso quando presente em
alimentos é a Staphylococcus aureus, que apesar de raramente causar algum dano
ao indivíduo, em alguns grupos imunocomprometidos pode se tornar perigosa.
A indústria de alimentos é responsável pela análise e identificação desses
microrganismos, e utiliza diversas técnicas para obter o resultado de suas análises.
Um dos métodos utilizados é a Coloração de Gram, que identifica as bactérias
gram-positivas e gram-negativas através da coloração que apresentam. Bactérias
que apresentam coloração rosa/avermelhada são gram-negativas, enquanto as que
apresentam coloração azul/roxa são gram-positivas.
Através da coloração de Gram podemos visualizar mais claramente a
estrutura, morfologia, tamanho e agrupamento do microrganismo, tornando mais
fácil a sua identificação.
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2 DESENVOLVIMENTO

2.1 OBJETIVO GERAL

Ao final desta atividade experimental espera-se que o aluno seja capaz de:
- Realizar análises de identificação coliformes por tubos múltiplos (NMP);
- Realizar a semeadura em meios sólidos específicos para alimentos e analisar
os principais microrganismos causadores de toxinfecções alimentares;
- Realizar coloração de Gram, analisar, identificar diferenças morfológicas e
arranjos;
- Realizar a técnica de diferenciação do microrganismo através da prova da
catalase.

2.2 METODOLOGIAS

2.2.1 ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP)

2.2.1.1 MATERIAL E REAGENTE
Bico de bunsen,
Alça de platina,
Pissete com Alcóol 70%,
tubos de Durham estéreis,
béquer de 100 mL,
proveta de 50 mL,
tubos de caldo EC ou caldo Mac Conkey ou caldo BHI estéreis com tampa.
tubos de caldo BHI com 7,5% NACL com tampa e estéril.
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2.2.1.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A técnica de tubos múltiplos é a mais tradicional para a análise de coliformes (totais
ou termotolerantes) e E.coli. Esta metodologia permite a quantificação por “número
mais provável” (NMP) de microrganismos e é dividida em duas fases sucessivas,
uma presuntiva e outra confirmativa. E esta última somente é realizada se houver
crescimento positivo na etapa presuntiva.
O procedimento da fase presuntiva consiste em fazer a homogeneização e
transferência de alíquotas e/ou diluições da amostra para tubos de ensaios
contendo, no fundo, um tubo invertido para coleta de gás (tubo de Durhan), e o meio
de cultura apropriado (caldo lauril triptose). Todos os tubos são incubados a 35°C
durante 24 a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento
(positivo) de coliformes totais, resultado identificado pela ocorrência de reação ácida
(coloração amarelada) ou produção de gás (retida no tudo de Durhan).
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de
platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que
no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24
a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de
coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de
Durhan.
Na fase confirmativa, efetua-se o repique (transferência de alíquotas com alça de
platina) dos tubos presuntivos positivos para tubos preparados da mesma forma que
no anterior, porém contendo caldo. Todos os tubos são incubados a 35°C durante 24
a 48 horas e posterior identificação dos que tiverem crescimento (positivo) de
coliformes totais, identificado pela ocorrência de produção de gás nos tubos de
Durhan.
(A fase complementar serve para identificação dos coliformes termotolerantes,
na qual faz-se o repique dos tubos presuntivos para outros tubos, desta vez
contendo meio EC (recomenda-se que seja feito simultaneamente ao teste
confirmativo), que deverão ser incubados a 44,5ºC durante 24 horas. Todo este
procedimento totaliza no mínimo 72 horas para obtenção de resultado positivo para
coliformes termotolerantes.)
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2.2.1.3 ANÁLISE DOS TUBOS (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA

POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA)

De acordo com o número de tubos positivos em cada uma das diluições e das fases
utilizadas, determina-se o número mais provável (NMP), tendo como base tabelas
estatísticas.
Acesse as tabelas de NMP e os procedimentos completos para análise de
coliformes, segundo o FDA, no link:
http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm
#tab1
Usando a Tabela, é possível estimar o número de organismos a partir de qualquer
combinação de resultados positivos e negativos com 95% de confiança dos dados.

2.2.2 SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS

Semeadura e isolamento
Material enriquecido em caldo TSB de swab ou “in natura”:
Placas: esgotar o material em um ponto da placa e com a alça comum de níquel-
cromo flambada e fria, realizar a semeadura com estrias para isolamento a partir do
ponto de aplicação da amostra (semeadura direta) (Fig 1 a 4);
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Fig 1 Fig 2 Fig 3 Fig 4 Fig 5

As placas a serem utilizadas serão Agar MacConkey e Agar Manitol.

Levar para a estufa a 36,5°C por 24h, para obter a multiplicação dos Mos. Do meio.

2.2.3 Avaliar o crescimento microbiano nos diferentes meios de cultura e realizar a

identificação dos microrganismos.
(ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA
SEMANA)

Interpretação
Crescimento no Agar MacConkey – Gram Negativos
Fermentadores de Lactose – Colônia Rosa
Não Fermentadores de Lactose – Colônia Incolor ou Branca
Crescimento no Agar Manitol – Gram Positivas
Colônia pequeno e rodeadas de uma zona vermelha – estafilococos não-
patogênicos
Colônia maiores e rodeadas de uma zona amarela – Staphylococcus aureus
fermentadores do manitol

2.2.4 Prova da catalase

Quando houver suspeita de cocos Gram-positivos, realizar uma bacterioscopia e
depois a prova da catalase.
a) Em um tubo de ensaio limpo, colocar cerca de 5 mL de peróxido de hidrogênio 20
volumes
b) Com auxílio de uma alça, transferir uma colônia para o tubo e emulsioná-la no
peróxido.
c) Um desprendimento intenso de bolhas indica resultado POSITIVO.
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2.2.4 Coloração de Gram

1 INTRODUÇÃO
A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias que consiste no
tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os
reagentes cristal violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. Essa técnica permite
a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a
determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. O método da
coloração de Gram é baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias
Gram-positivas de reterem o corante cristal violeta no citoplasma durante um
tratamento com etanol-acetona enquanto as paredes celulares de bactérias Gram
negativas não o fazem.

2.2.4.1 OBJETIVO
Nesta aula o aluno irá executar o método de coloração de Gram, em esfregaços já
previamente preparados e fixados pelo calor. Posteriormente, o aluno realizará a
visualização dos esfregaços corados no microscópio óptico empregando a objetiva
de imersão, deverão ser capazes de caracterizar a morfologia individual, a formação
de agrupamentos e diferenciação da coloração da célula bacteriana.

2.2.4.2 MATERIAL E REAGENTE

Bico de Bulsen,
• Alça de Platina;
• Tubos de Ensaio;
• Algodão;
• Estante para tubo de ensaio;
• Conta-gotas;
• Placa de Patrick;
• Hagar Chocolate;
• Microscópio Ótico
• Lâmina
• Lamínula
• Cristal Violeta
• Lugol
• Fucsina
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2.2.4.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Com todos os materiais sobre a bancada inicia-se pelo processo de esterilização da
alça de platina sobre o bico de bulsen, para esterilizá-la deve-se segurá-la da
mesma forma como se segura uma caneta, e rodá-la em cima do bico de bulsen
para que o fogo percorra toda sua extensão, depois deve-se incliná-la
aproximadamente 45º e esperar que ela fique incandescente; após a esterilização a
alça de platina deve ficar apoiada no bico de bulsen para que ela não saia da área
de proteção do mesmo. Tudo que for pego com a mão direita ou esquerda deve-se
permanecer neste mesmo lado, visto que a troca de objetos de uma mão para a
outra pode ocasionar acidentes devido ao risco que o bico de bulsen apresenta por
se tratar de um emissor de chama.
Manuseando na área de segurança, pega-se o tubo de ensaio, retira-se o algodão
que está tampando-o e com um conta gotas coleta-se a salina que está no tubo;
esta salina deve ser pingada (uma gota) na lâmina que vai ao microscópio; no final
deste procedimento deve-se passar o tubo de ensaio no bico de bulsen e tampá-lo
novamente com algodão. Segurando de maneira leve a alça de platina, deve se abrir
a placa de Patrick e esfregar a alça nela superficialmente para que possa ser
retirada uma finíssima camada de microrganismos
que ali cresceram; tampa-se novamente a placa e realiza-se um esfregaço desta
camada na lâmina que contêm a salina.
Com o bico de bulsen aceso, e com um prendedor segurando a lâmina, realiza-se a
secagem da placa de maneira lenta, sem que ela corra risco de estourar.
Após a secagem foi realizado o processo de coloração; para corar devem-se realizar
os seguintes passos:
a. Pingar o cristal violeta e esperar um minuto
b. Sobre ele pingar lugol e esperar mais um minuto,
c. Colocar solução de álcool cetona e lavar com água,
d. Cobrir com Fucsina e esperar 30 segundos,
e. Lavar e deixar secar.
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2.2.4.4 ANÁLISE E LEITURA (ESSA ETAPA SERÁ ANALISADA

POSTERIORMENTE NA AULA DA PRÓXIMA SEMANA)

Observar ao microscópio em menor aumento e, a seguir, colocar 1 gota de óleo

mineral na lâmina e focalizar com objetiva de imersão.
Desenhar as bactérias observadas considerando o tipo de coloração (Gram + ou -),
a forma e o arranjo das células.
Após o uso, a objetiva de imersão deve ser limpa com papel absorvente.
As bactérias que tiverem a característica irão formar cristais violeta em seu interior e
se diferenciarão das demais pela coloração mais acentuada.

Morfologia Arranjo Gram

Cocos Estreptococos Positiva
Bacilos Estreptobacilos Negativa
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3 RESULTADOS

3.1 SEMEADURA EM MEIOS SÓLIDOS

 Identificamos as placas Agar MacConkey e Agar Manitol;

 Esterilizarmos a alça no fogo do bico de bunsen;

 Pegamos uma amostra da bactéria S. aureus e adicionamos na placa Agar

Manitol;
 Esterilizamos novamente a alça e pegamos uma amostra da bactéria E. coli e
transferimos para a placa Agar MacConkey;

 Adicionamos as amostras a estufa e analisaremos na próxima aula os

resultados obtidos.
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 Uma semana após realizarmos a semeadura, voltamos ao laboratório para

iniciarmos a análise das amostras.
 Ao analisarmos as placas, conseguimos identificar que a placa Agar
MacConkey apresentou um arranjo avermelhado que caracteriza positividade
para a presença de E. coli.

 Já na placa contendo Manitol formou-se uma película de coloração amarelada

confirmando a presença de S. aureus.

 Após a análise de placas, continuamos nosso processo de identificação

realizando a coloração de gram.
 Em uma lâmina adicionamos a nossa amostra de cultura 1 gota de violeta
genciana (aguardamos 1 minuto), 1 gota de lugol (aguardamos 1 minuto), 1
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gota de álcool acetona (aguardamos 1 minuto), lavamos com água destilada,

(aguardamos 30 segundos) e adicionamos 1 gota de fucsina e esperamos a
lâmina secar.
 Após a secagem adicionamos 1 gota de óleo de imersão na lâmina e
iniciamos o processo de identificação no microscópio com a lente objetiva de
100x.
 Durante a visualização conseguimos identificar as bactérias, sendo
distinguidas através da coloração, onde a E. coli presentou coloração
rosa/avermelhada e em formato de bastões e a S. aureus apresentou
coloração arroxeada e em formado de cocos aglutinados.

E. coli

S. aureus
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3.2 ANÁLISES DE COLIFORMES POR TUBOS MÚLTIPLOS (NMP)

 Identificamos 4 tubos, sendo 2 tubos de NaCl +BHI e 2 tubos somente com

BHI;

 Nos tubos de NaCl + BHI, colocamos 1ml de leite fermentado Yakult®,

contaminado com E. Coli em um dos tubos e no outro tubo 1ml de leite
fermentado contaminado com S. Aureus;
 Nos tubos contendo somente BHI fizemos o mesmo processo descrito acima.
 Na próxima aula realizaremos a análise dos resultados.
 Após uma semana voltamos ao laboratório para iniciarmos a análise dos
resultados;
 Os tubos contendo S. Aureus indicaram positividade para a presença da
bactéria por conta da formação de bolhas ao adicionarmos a amostra em
peróxido de hidrogênio.
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3.3 VISUALIZAÇÃO DE FUNGOS EM MICROSCOPIA

 Utilizamos 1 mamão contaminado com bolor;

 Pegamos uma amostra do bolor e realizamos o esfregaço na lâmina;

 Acrescentamos 1 gota de azul de metileno a lâmina;

 Visualizamos a lâmina no microscópio com a lente objetiva de 10x e 100x.
 Identificamos os fungos na lâmina que estavam presentes com a coloração
azulada e em formato arredondado e estriado.

Lente 10x
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Lente 100x
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4 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

Através das técnicas realizadas conseguimos visualizar as diferentes

morfologias que as bactérias apesentam.
Na semeadura em placas, pudemos identificar através de seus meios de
cultura, as diferenças apresentadas a olho nu entre as duas bactérias analisadas, e
através da microscopia conseguimos visualizar a coloração e a morfologia que cada
uma delas apresenta, sendo a bactéria E. coli de coloração avermelhada e em forma
de bacilos (que a caracteriza como gram negativa) e a S. aureus de coloração
arroxeada e em formato de cocos aglutinados (que a caracteriza como bactéria gram
positiva).
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ANEXO

TÉCNICAS DE SEMEADURA

Semeadura em Placas de Petri:

O material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos porque o inóculo
para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de
um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o
número, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento
confluente. Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este
poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento
adequada.
Estrias Múltiplas para Isolamento: Consiste em espalhar o material com o auxílio de
uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material,
de modo a obter-se um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra.
Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. A semeadura poderá
ser realizada em um sentido ou em vários, de acordo com a pessoa que realizará a
técnica, lembrando-se sempre que o objetivo principal desta técnica de semeadura é
a obtenção do isolamento bacteriano.

Semeadura em Meio Líquidos:

Difusão: Técnica que consiste em acrescentar microrganismos através da alça ou
agulha de platina em meios líquidos. Tem como principal finalidade a observação de
propriedades bioquímicas através de testes microbiológicos, bem como poderá ser
utilizada para o favorecimento do crescimento bacteriano, quando é realizada em
meios que possibilitem o enriquecimento.

Técnica para semeadura em meios líquidos:

Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na
amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás
da chama para proteção do operador);
Retirar a rolha de algodão do tubo que contém o microrganismo a ser semeado ou
repicado (que deverá estar na mão esquerda) utilizando-se o dedo mínimo da mão
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direita. A ROLHA OU TAMPA DEVERÁ PERMANECER SENDO SEGURA COM O

DEDO MÍNIMO, ATÉ O FINAL DA OPERAÇÃO;
Flambar a boca do tubo, e retirar o inóculo com a alça fria;
Flambar novamente a boca do tubo e fechar;
Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar;
Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar;
Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa
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REFERÊNCIAS

BERNARDES, Nicole Blanco; FACIOLI, Larissa de Souza; FERREIRA, Maria Luzia;

COSTA, Raissa de Mour; SÁ, Ana Cristina Fonseca de. Intoxicação Alimentar um
Problema de Saúde Pública. Id on Line Rev.Mult. Psic., 2018, vol.12, n.42, p. 894-
906. ISSN: 1981-1179.

Alves, A. R. F. Doenças alimentares de origem bacteriana. 87f. Dissertação

(Mestrado em Ciências Farmacêuticas). Faculdade de Ciências da Saúde,
Universidade Fernando Pessoa, Porto, 2012.

JACOB, Fernando Rodrigues; GATTI, Luciano Lobo. IMPORTÂNCIA DA

COLORAÇÃO DE GRAM NO DIAGNÓSTICO MICROBIOLÒGICO E VARIAÇÕES
NA SUA EXECUÇÃO. Disponível em:
<https://cic.unifio.edu.br/anaisCIC/anais2016/pdf/09_05.pdf> Acesso em: 19 nov.
2022.