Aplicao de mtodos alternativos

para anlise microbiolgica de

alimentos

Profa. Msc. Leila Larisa Medeiros Marques

Mtodos utilizados em
microbiologia de alimentos

Mtodos tradicionais ou convencionais;

Mtodos rpidos ou alternativos.

Mtodos tradicionais ou
convencionais
Pouco elaborados;
Trabalhosos;
Demorados;
Muito material de laboratrio;
Requer pessoal treinado;
Sujeito a falhas humanas.

Mtodos tradicionais ou
convencionais

Sensibilidade insuficiente: capacidade de detectar

o que o mtodo prope;

Especificidade: detecta s microrganismos

procurados nem sempre ocorre;

Repetitividade: se o operador fizer 50 vezes ele

obtm o mesmo resultado - no ocorre;

Reprodutibilidade: gera resultados

estatisticamente iguais - nem sempre ocorre!

Mtodos convencionais

Foram desenvolvidos h muitos anos e vm sendo

empregados como mtodos oficias na maioria dos
laboratrios brasileiros e outros pases;

Esses mtodos esto descritos em publicaes consideradas

de referncia, internacionalmente aceitas:

-Bacteriological analitical manual (ed. 1992) - (FDA) e (AOAC);

-Compendium of methods for the microbiological examination
of foods (APHA) (ed. 1992);
-Microorganisms in foods (ed. 1978) (ICMSF);
-ISO - International Organization for Standardization;
-IDF - International Dairy Federation.

Mtodos tradicionais ou
convencionais
1. ANLISE QUANTITATIVA - MTODOS DE CONTAGEM DE
MICRORGANISMOS
A) Contagem de colnias de microrganismos em placas de petri
- Em profundidade " pour - plate"
- Na superfcie do meio
B) Tcnica de contagem por membrana filtrante
C) Tcnica da determinao do nmero mais provvel (NMP)

2. ANLISE QUALITATIVA
-Tcnica de presena/ausncia

Anlise quantitativa mtodos de contagem de

microrganismos

Contagem de colnias de microrganismos em placas

de petri

1- Tcnica de semeadura em superfcie;

2- Tcnica de Pour-Plate ou de profundidade;
3- Tcnica de sobrecamada.

Vantagem: Rapidez Resultados

em 24 ou 48 Horas?

Objetivos dos mtodos rpidos

em anlises microbiolgicas
1. Melhorar a eficincia dos laboratrios,
simplificando trabalhos, reduzindo o custo no
geral, aumentando a capacidade analtica;
2. Aumentar confiabilidade dos resultados, pois
no preparado pelo analista, o kit vem pronto;
3.Aumentar a preciso dos resultados.

***Importante: ter um microbiologista treinado

para interpretao

Mtodos rpidos ou alternativos

1) Automao laboratorial;

2) Mtodos rpidos para avaliar a

qualidade;

3) Mtodos rpidos para avaliar

inocuidade.

1. Automao industrial
A) Pesagem ("Diluter");
B)
Homogeneizao
("stomacherhomogeneizador de pisto");
C) Semeadura ("Spiral plater");

D) Plaqueamento
cromognicos).

(uso

de

meios

1.Automao laboratorial

A. Preparo de meios de cultura = masterclave

Bioscan -Dispenser em placas de Petri -750
placas/hora;

B. Pesagem de amostras-por ex: atravs de um

aparelho chamado DILUTER -ajustado que ao
colocar a amostra, pesa a alquota desejada, e j
dilui acrescentando a gua necessria para a
diluio!

1.Automao laboratorial

C. Homogeneizao - Uso do stomacher homogeneizador de pisto no mais os

liquidificadores que cortam as clulas
microbianas injuriando-as na anlise!!!

D. Semeadura - Utilizao de um aparelho

chamado spiral plater - a amostra semeada
na placa, atravs de uma cnula, que verte o
inculo, e a placa fica numa superfcie que gira.

2. Mtodos para avaliao da

qualidade

Microrganismos
deteriorantes/Indicadores

Mtodos de contagem-direta e
indireta

Contagem Direta

1. Membrana filtrante: utilizada para lquidos onde grande

quantidade necessitada para amostra: utilizada em gua,
refrigerantes.

2. Mtodos de contagem fluorognicos: como LST MUGbaseado na propriedade da E. coli de emitir fluorescncia na
presena deste composto, o indicador procurado, adiciona-se MUG
(u-metil umbeliferil beta-d-glicorondeo) ao caldo da cultura
(presuntivo). O nmero de tubos com gs e fluorescentes aps 24h,
ou 48h, sob luz ultra-violeta visvel, d o nmero mais provvel de
E.coli por grama.
*Meios cromognicos prontos:exploso em 2007

Contagem direta- Meio

cromognico: gar Rambach

Contagem direta- Petrifilme

Contagem direta- Petrifilme

Contagem direta- Petrifilme: tcnica para anlise

de Escherichia coli
1

Contagem direta- Petrifilme: tcnica para

anlise de Enterobacteriaceae

Contagem direta- Petrifilme: tcnica para

anlise de bolores e leveduras

Contagem direta- Petrifilme: tcnica

para anlise de S. aureus

Petrifilm: cuidados
Armazenar os pacotes fechados na geladeira;
Antes de abrir aguardar para que o pacote esteja a temperatura
ambiente;
Depois de aberto deixar a temperatura ambiente por no mximo 30
dias;
No usar placas que estejam laranja ou marrom;
Verificar a data de vencimento;
Para descartar, esterilizar;
Contagem :
Contar placas com mais de 250 colnias;
Contar um ou mais quadros, fazer a mdia e multiplicar por 20;
As colnias podem ser tiradas para identificao;
Congelar a < - 15C at 1 semana.

Contagem direta: outros mtodos

LST MUG: Colilert; sistemas prontos para
uso (placas de simplate);
placas de Petrifilme - 3 M;
placas de compact dry - Versus- Madasa.

Contagem indireta

1. Bioluminescncia;

2. Impedncia/Condutncia.

Contagem indireta: tcnica de

bioluminescncia

Princpio: quantidade de ATP detectada a partir de

clulas metabolicamente ativas (resduos orgnicos,
inclusive microrganismos). Em ambiente de produo,
monitoramento microbiolgico;

Mecanismo: Reao de enzima luciferina-luciferase

(cauda do vaga-lume);

ATP -Reage com a enzima produzindo luz, medida em

um luminmetro.

Contagem indireta: tcnica de

bioluminescncia

Aplicao comum: monitoramento

de
higienizao
em
plantas
processadoras de alimentos;
Equipamentos comercializados
base de bioluminescncia: Lightning e
Hi-Lyte;
Consistem em um swab aplicado a
superfcie a ser checada: introduz
num tubo com os reagentes
necessrios e o coloca no
luminmetro
que
mede
a
intensidade da luz: quanto mais sujo,
+ luz!
Existem vrios fabricantes desse tipo
de equipamento.

Contagem indireta: tcnica de

bioluminescncia

Contagem Indireta:
IMPEDNCIA/CONDUTNCI
A

Princpio: microrganismos alteram a corrente eltrica de um meio

de cultura devido s atividades metablicas na multiplicao.
Molculas grandes (protenas, lipdeos) so transformadas em
molculas menores; aminocidos, ac. graxos, etc., que so
quimicamente mais ativas. O acmulo destes compostos produz
alteraes mensurveis.
Ex.: BACTOMETER-Bio Mrieux. A quantidade de microrganismos
presentes definida pela determinao do TEMPO DE
DETECO
Deteco ocorre quando a [ ] atinge 106-107microrg./ml.

3. Mtodos Rpidos Para

Avaliao De Inocuidade
Kits completos de identificao:
A. BIOQUMICOS
B. IMUNOLGICOS
C. MOLECULARES

3. Mtodos Rpidos Para

Avaliao De Inocuidade
A. Bioqumicos:
Mtodos que a partir de uma cepa obtida por algum mtodo de
deteco - inoculada em kits -e so observadas para capacidade
de realizar determinadas reaes bioqumicas;

Entram na fase final da anlise objetivo de identificar. Ex: Galerias

API, Bio-Mrieux

Testes complementares de identificao. Ex: Microgen Listeria ID, da

Bioscan.

3. Mtodos Rpidos Para

Avaliao De Inocuidade
Imunolgicos:
Imunoenzimticos;
Imunocaptura;
Imunoimobilizao;
Coaglutinao.

3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De

Inocuidade: imunoenzimticos

O tipo mais empregado: sandwich;

O patgeno PROCURADO capturado da amostra por

anticorpos adsorvidos superfcie de uma matriz slida (esferas de
polietileno, placas de micro-titulao, papel, etc.);

O complexo antgeno-anticorpo reage com o conjugado, forma

novo anti-corpo especfico p/ o microrganismo em teste. Ligada
enzima cromognica (fosfatase alcalina/peroxidase), o sandwich
reage com o substrato da enzima cromognica e mostra cor: teste
positivo.

Ex. Unique,Vidas -Bio Mrieux-automatizado

3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De

Inocuidade: imunocaptura

Princpio: capacidade dos microrganismos aderirem superfcie de

partculas metlicas revestidas de anticorpos especficos;

Ligando os antgenos bacterianos + anticorpos: o sistema tem um

suporte com m que atrai as partculas metlicas, e o que fica um
concentrado de microrganismos procurados.

Enriquecimento e plaqueamento!

Sorologia: deve ser feita em colnias suspeitas, dando assim

resultado imediato.

3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De

Inocuidade: Imunoimobilizao

Princpio: bactrias mveis cultivadas em meios semi-slidos tem

sua mobilidade bloqueada pela adio de anticorpos flagelares
especficos;

Forma uma banda de

ANTICORPO/BACTRIA;

Aplicvel a qualquer microrganismo flagelado (mvel);

Ex.Teste 1-2 da Bio-Control p/ Salmonella.

precipitao

visvel

na

interface

3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De

Inocuidade: coaglutinao

Conhecido como aglutinao de ltex (passiva reversa);

Uso em toxinas microbianas;

Aglutinao de partculas de ltex sensibilizadas com

anticorpos anti-toxinas.;

Ex.: RPLA kits_OXOID p/ pesquisa de enterotoxinas

estafiloccicas.

3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De

Inocuidade: mtodos moleculares

Sondas genticas -pouco usadas: Separa

fita de DNA-sonda reage marcador cor
que lida no colormetro;

PCR -Tradicional e automatizado -Ex:

BAX
SYSTEM
-Dupont-QualicomPatgenos alvo: Salmonella, Listeria
monocytogenes e Listeria sp, Enterobacter
sakazakii, Escherichia coli O157:H7, Bolores
e Leveduras;

Ribotipagem-Ribotipo-Sofisticao em
anlises -Riboprinter-Dupont-QualicomRG .

3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De

Inocuidade: PCR tradicional

3. Mtodos Rpidos Para Avaliao De

Inocuidade: ribotipagem

Referncias bibliogrficas

FRANCO, B. D. G. M. Mtodos rpidos em microbiologia de

alimentos - Curso Mtodos de Anlise em Microbiologia de
Alimentos -ITAL, 2006.

SILVA, N.; JUNQUEIRA,V. C. A.; SILVEIRA, N.;TANIWAKI, M.H.;

SANTOS, R. F. S.; GOMES, R. A. R. Manual de mtodos de
anlise microbiolgica de alimentos. 3ed. So Paulo: Varela,
2007.