UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Microbiologia
Métodos em Microbiologia (MIC815)

Relatório de Aulas Práticas:

Módulo de Virologia

Alunos: Paula v R.C

Jorge Lucas

Professores: Jordana GA Coelho-dos-Reis

Ana Gabriella Stoffella Dutra
Erik Vinicius de Sousa Reis
Mateus Sá Magalhães Serafim
Thaís de Fátima Silva Moraes

Belo Horizonte, 13 de setembro de 2023.

Prática I – Introdução ao Módulo de Boas Práticas Laboratoriais

1. INTRODUÇÃO
O ambiente laboratorial seja para prestação de serviços ou para
pesquisa científica necessita de vários fatores para determinar seu
funcionamento adequado.
Seguindo normas específicas, cada laboratório tem capacidade de se
estruturar quanto ao espaço disponível, disposição de equipamento e fixação
de um fluxograma laboral.

2. OBJETIVO
 Demonstração da disposição laboratorial;
 Apresentação do fluxograma de um laboratório de virologia;
 Preparo de material estéril em laboratório de virologia;
 Preparo de reagentes e meio de cultura.

3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material:
- Frascos para cultura de células;
- Pipetas sorológicas descartáveis;
- Papel toalha;
- Meio de cultura MEM;
- Álcool 70% v./v.;
- Papel grau;
- Bomba a vácuo;
- Sistema de filtração com membrana de 0,22 micrômetros;
- Caixas de ponteiras de 1 mL, 200 uL e 10 uL;
- Papel Kraft.
3.2 Procedimentos:
O Laboratório de Vírus localizado no ICB/UFMG conta com as seguintes áreas:
a) Escritório: espaço de recepção utilizado para estudo com computadores de
mesa, armários para guardar material pessoal e salas individuais para os
chefes de laboratório;

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b) Lab 1: neste espaço as amostras biológicas são recebidas e é onde a
paramentação do usuário é feita. O Lab 1 conta com um fluxo para
manipulação de amostras e um fluxo para pipetagem de DNA/RNA. Há um
espaço “livre de contaminantes” separado para o preparo do mix de PCR e um
espaço para os termocicladores para PCR convencional e PCR em tempo real;
c) Lab 2: Esta área conta com 3 fluxos, 2 estufas com controle de CO 2 e outra
a 30°C (destinada a cultivo de amebas infectadas por vírus gigantes). No Lab 2
são realizados os procedimentos de titulação, soroneutralização e extração de
DNA/RNA;
d) Lab 3: Este local é destinado para corridas de eletroforese, extração de
ácidos nucleicos em tecido e realização de Western Blot;
e) Lab 4 (cozinha): Este é o local onde ocorre a descontaminação, lavagem e
esterilização de materiais do laboratório que poderão ser descartados ou
reutilizados. Conta com uma sala anexa para autoclavação com 2 autoclaves
verticais e uma horizontal. Duas são utilizadas somente para esterilização de
material e uma para descontaminação.
Em um segundo momento da aula, visitamos a sala de cultura de células
que possui 3 fluxos, 2 microscópios, armário com garrafas de culturas
esterilizadas, microondas, uma geladeira, um freezer, 2 estufas de CO 2 e, em
um anexo, uma câmara fria para armazenamento de soluções e meios. Para
exemplificar, acompanhamos o método de filtração do meio MEM por sistema
de filtração à vácuo com membrana PES 0.22 µm.

Figura 1: Sistema de filtração à vácuo com membrana PES 0.22 µm (Kasvi)

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Uso da autoclave:
O uso da autoclave envolve atenção constante do operador que deve
verificar a quantidade de água, a variação de temperatura do aparelho e
contagem do tempo de esterilização. Na hora de retirar o material não se deve
ter pressa pois isto pode gerar acidentes como queimaduras. A secagem do
material garante a manutenção da esterilidade do mesmo.
 Filtragem do meio:
A atenção do operador deve começar desde a disposição do material a
ser utilizado. Evitar gestos como passar as mãos por cima do frasco aberto ou
colocar a tampa de borda para baixo podem eliminar possíveis contaminantes.
Ao usar a bomba deve haver o controle para que a membrana não rompa e,
caso o meio caia no fluxo, eliminar de imediato com uso de etanol 70%.

5. CONSIDERAÇÕES GERAIS
 Se possível sempre realizar os procedimentos em duplas
 Planejar o tempo que irá gastar
 Informar caso desconfie da segurança de algum procedimento que realizou

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 FRESHNEY, R. Ian. Aseptic technique. Culture of Animal Cells: A Manual
of Basic Technique, 2005.

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Prática 2 – Cultura celular e titulação viral pelo método da formação de
placas de lise

1. INTRODUÇÃO
1.1 Método da formação de placas de lise
O método da formação das placas de lise baseia-se na inoculação de
amostras contendo vírus de interesse em células suscetíveis e, por meio da
atividade citolítica viral, pode-se estimar a quantidade de partículas virais
presentes na amostra. Diluições seriadas na base dez do vírus a ser testado
são inoculadas em monocamadas de células. Após o período de incubação
que permite a adsorção dos vírus às células, é adicionado um meio de cultura
semi-sólido que possibilita a visualização da formação das placas de lise. O
meio semi-sólido previne a disseminação do vírus na cultura entre células
distantes, mas permite que ocorra uma transmissão célula-a-célula. A
viscosidade do meio utilizado nesse ensaio permite, portanto, que as partículas
virais liberadas permaneçam na vizinhança da primeira célula infectada. Essa
condição de cultivo permite identificar a infecção de uma partícula viral
individualizada, definida como unidade formadora de placa (UFP), do inglês
“plaque-forming unit” (PFU) (FIELDS et al., 2005).
Dessa forma, a infecção por vírus citopáticos causa a formação de uma
área clara indicando o dano ou morte celular após um período variável de
incubação. Mesmo que as células não morram ou sejam lisadas, a alteração
das células em uma determinada área causada pela infecção localizada de um
vírus pode ser facilmente observada como uma placa de lise ou infecção focal.
O cálculo baseia-se na contagem do número de placas de lise observado, no
fator de diluição e no volume de amostra usada. O resultado é expresso em
Unidade Formadora de Placas (UFP) por mL de amostra. Sendo uma
metodologia que pode ser usada para titulação viral, soroneutralização,
atividade antiviral e estudo de fenótipos de placa.
1.2 Cultura celular
O cultivo celular pode ser entendido como a manutenção de células
eucarióticas in vitro sob condições controladas, a fim de mimetizar um
comportamento tecidual. Podemos citar 3 tipos: cultivo primário, cultivo de
linhagem contínua e de células transformadas (ALVES et al., 2010). As células

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de linhagens celulares contínuas são aquelas que, após inúmeros repiques,
mantêm as características do tecido de origem e possuem alta proliferação.
Essas linhagens são muito utilizadas em pesquisa por poderem ser repicadas
por até oitenta passagens, não perdendo suas características no processo de
propagação. A ATCC utilizada nas aulas práticas é a Vero CCL-81, células
epiteliais do rim da espécie Cercopithecus aethiops, conhecido vulgarmente por
macaco do velho mundo. Essas células devem ser cultivadas a 37°C com 5%
de CO2 (ATCC, 2023).
A Vero é uma linhagem aderente que necessita de ancoragem por meio
da adesão a uma superfície de contato para sua proliferação, o que a
diferencia de linhagens que crescem em suspensão, como a linhagem HKB-11.
Para esse tipo de células, as garrafas de cultivo devem possuir uma carga
negativa que permite a produção de proteínas de adesão e proteoglicanos da
matriz extracelular que interagem com a carga negativa da superfície, dando
início ao processo de adesão das células à garrafa (MOLINARO et al., 2013).
O repique é a técnica básica de manutenção das células in vitro. Quando
as células atingem uma alta densidade e a monocamada apresenta mais de
90% de confluência, frações dessas células devem ser transferidas para outros
recipientes de forma que a propagação celular não seja prejudicada. Além disso,
células mortas e metabólitos das células presentes no meio devem ser
descartados e mais nutrientes devem ser disponibilizados com a troca do meio.
As células são separadas pela ação da tripsina nas junções celulares
(caderinas). Dessa forma, é necessário lavar a monocamada antes da
tripsinização para remover possíveis inibidores e/ou competidores, como, por
exemplo, o soro fetal bovino. Todo o processo deve ser realizado em ambiente
estéril para garantir a viabilidade das células após o manuseio.

2. OBJETIVO
2.1 Método da formação de placas de lise
 Observar a formação das placas de lise decorrentes da infecção viral e
quantificar as partículas virais ao final do ensaio;
 Observar os efeitos citopáticos causados pela infecção viral por
microscopia óptica;

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  Aplicar os conceitos de boas práticas laboratoriais na execução dos
ensaios.
2.2 Passagem de células em cultivo
 Compreender o sistema experimental usado na rotina de propagação de
vírus: as culturas de células e tecidos obtidas in vitro;
 Aplicar os conceitos de boas práticas laboratoriais.

3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
- Estantes para tubos e eppendorfs;
- Frascos para cultura de células;
- Micropipetas de volume variável;
- Papel toalha;
- Placas de cultivo celular de seis poços;
- Pipetas sorológicas descartáveis;
- Pipetador automático;
- Ponteiras com filtros;
- Tubos eppendorf;
- Tubos falcon de 15 e 50 mL.
3.2 Reagentes
- Álcool 70% v./v.;
- Linhagem celular Vero CCL-81;
- Meio de cultura CMC 1% (carboximetilcelulose);
- Meio de cultura MEM (Earle);
- Solução de formol 10% e formalina 3,7%
- Solução de cristal violeta 1%;
- Soro fetal bovino (SFB);
- Tampão fosfato-salina (PBS);
- Tripsina.
3.3 Equipamentos
- Cabine de Segurança Biológica (CSB);
- Estufa;
- Microscópio invertido;
- Vórtex.
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3.4 Procedimentos
3.4.1 Cultivo celular
As células da linhagem Vero CCL-81 foram previamente cultivadas em
garrafas de 25 cm2 em meio MEM suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino
(SFB) para subsequente repique durante a aula prática. Para suplementação
do meio com SFB, foram adicionados 250 µL de SFB a 4,75 mL de MEM em
tubo falcon de 50 mL. O meio suplementado também foi utilizado na segunda
parte da aula prática. O repique foi realizado conforme as seguintes etapas:
- Descarte do meio MEM;
- Adição de, aproximadamente, 1 mL de PBS para lavagem da monocamada.
Homogeneizar e descartar o PBS. Repetir o procedimento de lavagem
descartando o PBS novamente;
- Adicionar 500 µL de tripsina e incubar em estufa a 37°C por 2-3 minutos;
- Após incubação, bater com as mãos na lateral da garrafa para soltar as
células (desprendimento mecânico);
- Avaliar se as células estão em suspensão na garrafa ao microscópio invertido;
- Adicionar 2,5 mL de meio MEM suplementado com 5% de SFB, completando
o volume da garrafa para 3 mL;
- Descartar 2 mL e, em seguida, acrescentar 4 mL, totalizando 5 mL de meio
MEM suplementado com 5% de SFB;
- Incubar a garrafa nas condições de cultivo apropriadas para a linhagem
celular utilizada.
3.4.2 Titulação viral por meio do ensaio de formação de placas de lise
Inicialmente, foi realizada a diluição seriada do vírus da febre amarela
para posterior inoculação em células Vero CCL-81 previamente cultivadas em
placas de 6 poços.
- Desinfetar a superfície de trabalho da CSB com álcool 70%;
- Expor a superfície sob luz ultravioleta (UV) por 15 minutos;
- Adicionar 450 µL de meio MEM suplementado com 5% de SFB nos
eppendorfs devidamente identificados com os valores das diluições de 10 -1 a
10-5;
- Adicionar 50 µL da suspensão viral previamente preparada no microtubo 10 -1
e agitar em vórtex. Repetir essa etapa sucessivamente até o final da diluição

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seriada, tomando o cuidado de agitar em vórtex a diluição recém-preparada
antes de passar para a próxima;
- Descartar o meio da placa de 6 poços, previamente preparada;
- Adicionar 400 µL de cada uma das diluições nos poços correspondentes e
devidamente identificados na placa dispensando o meio cuidadosamente na
parede do poço para não desestruturar a monocamada;
- Adicionar 400 µL de meio MEM suplementado com 5% de SFB no poço de
controle celular dispensando com cuidado na parede do poço para não
desestruturar a monocamada;
- Para adsorção dos vírus às células, a placa deve ser incubada por 1 hora, em
estufa de CO2 à 37ºC e deve ser homogeneizada de 10 em 10 minutos com
movimento em cruz para distribuição uniforme do inóculo em todo o poço;
- Após o período de incubação, é aconselhado retirar o inóculo para evitar que
a placa apresente o efeito cometa e favorecer a formação de placas de lise
mais uniformes. Pode-se retirar o meio pipetando tanto do sentido do inóculo
menos concentrado para o mais concentrado utilizando a mesma ponteira
quanto realizar a troca da ponteira para a retirada do meio de cada uma das
diluições;
- Após a retirada do meio MEM, o meio semi-sólido CMC 1% + 2% de SFB foi
acrescentado aos poços de forma a cobrir uniformemente a monocamada;
- A placa foi incubada por 5 dias;
- Após o período de incubação, as placas foram fixadas com aproximadamente
1 mL da solução de formol 10% e formalina 3,7% por 30 minutos. Essa solução
inativa o vírus, conserva o ambiente celular e fixa as células;
- A solução de formol deve ser retirada com cuidado e a lavagem deve ser feita
vertendo-se a água sobre a tampa da placa, de forma a distribuir de maneira
mais homogênea para não danificar a monocamada. A lavagem deve ser
realizada 3 vezes para a completa remoção do meio CMC. Caso o CMC não
seja devidamente retirado, pode prejudicar a leitura uma vez que possui muitos
artefatos;
- A coloração das placas é realizada com cristal violeta 1% por 10-15 minutos.
O volume aproximado é de 1 mL, o suficiente para cobrir toda a superfície do
poço;

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- Após período de coloração, procede-se à contagem das placas de lise,
avaliando a diluição que apresente de 30-300 UFP.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Repique de cultura
Após 2 dias de incubação da garrafa nas condições de cultivo
apropriadas para a linhagem celular utilizada, a cultura não apresentou
contaminação.

Figura 1 - Células Vero CCL-81 – repique 09/08/2023. Fonte: Erik Reis, 2023.

4.2 Titulação viral por meio do ensaio de formação de placas de lise

É possível observar na Figura 2, à esquerda, que o controle de
crescimento das células Vero CCL-81 apresentou a confluência esperada e
não apresentou contaminação. Na imagem ao lado, à direita da Figura 2
(aumento de 4x), indicado pela seta, é possível observar a formação de uma
placa de lise, com uma área de células espaçadas, indicando a ação citotóxica
do vírus da Febre Amarela. As Figuras 2 e 3 mostram o mesmo campo do poço
da diluição 10-4 em aumentos de 4 e 10x, respectivamente. Apenas nessa
diluição foi possível visualizar a formação das placas de lise devido à baixa
confluência das células (Figura 4).

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Figura 2 - Células Vero CCL-81 após inoculação com o vírus da Febre Amarela. Aumento (4X).
Fonte: Erik Reis, 2023.

Figura 3- Células Vero CCL-81 após inoculação com vírus da Febre Amarela. Aumento (10x).
Fonte: Erik Reis, 2023.

Figura 4 - Placa após fixação e coloração. Seta vermelha indica pequenas áreas circulares
espaçadas relativas às placas de lise. Fonte: Paula Cardoso, 2023.

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 Para a titulação de vírus, idealmente, as células devem apresentar de 70
a 80% de confluência. No entanto, as células que foram previamente repicadas
para a aula prática estavam com baixa confluência (~ 30%) e a monocamada
não estava devidamente formada.

Figura 5 - Placa de titulação do vírus Zika em células Vero CCL-81 apresentada como modelo
do método estudado. Fonte: Paula Cardoso, 2023.

Uma placa de titulação do vírus Zika em células Vero CCL-81 foi

utilizada como modelo para compreensão do procedimento de leitura. Dessa
forma, a diluição escolhida para a contagem, deve apresentar de 30 a 300
placas de lise. No caso da placa da Figura 5, o poço indicado pela seta
apresenta o número de PFU suficientes para contagem e posterior cálculo.
Segundo Burlenson et al. (1992), o título viral é expresso por meio do número
de unidades formadoras de placa/mL (PFU/mL) e, portanto de partículas virais,
já que teoricamente, cada placa é iniciada pela infecção de um único vírus.
Sendo assim o título viral é calculado da seguinte forma:

 N° de placas de lise contadas x 1/diluição escolhida x volume do inóculo

Dessa forma, supondo que o poço indicado pela seta na Figura 5 seja da
diluição 10-4 e o volume inoculado na placa tenha sido de 400 µL:

 45 x 10.000 x 400 µL = 1,8 x 108

 Em 1 mL = 4,5 x 108

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5 CONSIDERAÇÕES GERAIS

A cultura de células é indispensável para o estudo da virologia e o uso de

células de mamíferos é uma ferramenta importante para a produção de vacinas
e métodos diagnósticos. Um laboratório de cultivo de células e tecidos deve
manter assepsia suficiente para que não ocorram contaminações da cultura por
microrganismos e, ao mesmo tempo, proteger ao máximo o manipulador.
Existem requisitos mínimos exigidos de boas práticas que devem ser adotados
para o perfeito funcionamento de um laboratório de cultivo celular. Para
manutenção da limpeza e assepsia do ambiente laboratorial, deve-se reduzir o
número de pessoas em circulação, na medida do possível.
Nesta aula prática não percebemos contaminações na cultura celular pura
ou após o início da titulação. Porém, percebemos que a taxa de confluência se
tornou um fator decisivo para o sucesso do procedimento.
Deste modo, deve-se atentar, em todas as etapas, para os protocolos e/ou
instruções das técnicas executadas, evitando possíveis erros e minimizando
riscos de acidentes e eventuais contaminações.

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALVES, Emanuele Amorim et al. Cultivo celular, 2010.

ATCC, 2023. Disponível online em: https://www.atcc.org/products/ccl-8. Acesso

em 18/08/2023.

BURLESON, F.G.; CHAMBERS, T.M.; WIEDBRAUK, D.L – Plaque assay. In

Virology: a laboratory manual. San Diego, Academic press, 1992.

FIELDS, B.N.; KNIPE, D.M.; HOWLEY, P.M.; CHANOCK, R.M.; MELNICK, J.L.;
MONATH, T.P.; ROIZMAN, B.; STRAUS, S.E. (eds). Fields Virology. 5ª ed.,
2005.

MOLINARO, E.M.; CAPUTO, L.F.G.; AMENDOEIRA, M.R.R. Conceitos e

Métodos para formação de profissionais em laboratórios de saúde: volume 3.
Rio de Janeiro, EPSJV,IOC, 2013. 306 p.

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Prática 3 – Ensaios Imunoenzimáticos

1 INTRODUÇÃO
1.1 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
A técnica ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) é muito
utilizada por sua praticidade e aplicação para diversos tipos de amostras, além
da alta sensibilidade e especificidade para a quantificação de anticorpos e
antígenos (BORGES et al., 2021). Inicialmente realizado com iodo radioativo, o
método foi modificado com a utilização de um sistema enzima-substrato para
detecção colorimétrica. Os quatro tipos principais de ELISA são conhecidos
como direto, indireto, sanduíche e de competição.
O ELISA direto é realizado utilizando um anticorpo de detecção primária
marcado com a enzima, formando assim um complexo antígeno-anticorpo.
O indireto é semelhante ao ELISA direto, mas um anticorpo secundário é
marcado com a enzima, apresentando maior especificidade na detecção. O
ELISA sanduíche é realizado utilizando um antígeno aderido a um suporte
como a placa (placa sensibilizada) seguido da adição da amostra para
pesquisa de anticorpos contra o antígeno. No ELISA de competição, a
presença de anticorpos na amostra é revelada pela competição com um
anticorpo conjugado específico (mono ou policlonal) contra o antígeno.
1.2 Teste rápido (imunocromatográfico)
O teste imunocromatográfico pode ser feito com amostras de sangue,
saliva, soro, plasma, secreção da nasofaringe e urina. A amostra é depositada
no local indicado com uma solução-tampão. O resultado é dado pelo
surgimento de marcadores coloridos em uma membrana de nitrocelulose ou
nylon coberta por acetato transparente para facilitar a visualização do teste que
possui áreas reagentes e outras bloqueadas com proteína inerte. O analito
reage nos locais correspondentes, formando um padrão que deve ser lido e
interpretado de acordo com as instruções do fabricante. Existem cinco
principais tipos de testes imunocromatográficos: imunocromatografia de fluxo
lateral, imunocromatografia de dupla migração, teste por aglutinação e teste
por fase sólida. Na imunocromatografia de fluxo lateral, o mostrador possui dois
marcadores: controle (C) e teste (T). A amostra e a solução-tampão são
colocadas no mesmo lugar, uma sobre a outra. Dali, os anticorpos fluem

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lateralmente pela membrana com a solução reagente, interagindo com os
marcadores C e T. Na área T, eles ligam-se ao analito investigado e na área C,
são capturados por anticorpos anti-imunoglobulina.

Figura 6- Ilustração do funcionamento de um teste rápido de fluxo lateral. Fonte: MS, 2020.

Figura 7 Leitura dos resultados. Fonte: MS, 2020.

O Zika IgG/IgM ECO Teste é um teste rápido imunocromatográfico que

pode detectar anticorpos do Zika vírus. A tira de teste contida no cassete
consiste em membrana de nitrocelulose contendo uma linha teste IgG (linha G),
uma linha teste IgM (linha M) e uma linha controle (linha C). As linhas testes e
linha controle não são visíveis antes da aplicação das amostras. A linha
controle é uma linha de referência que indica que o procedimento do teste foi
realizado adequadamente. Uma linha colorida G e/ou M será visível na janela
de resultados se IgG e/ou IgM anti-Zika estiver presente na amostra. Se o IgG
e/ou IgM anti-Zika não estiver presente na amostra, nenhuma linha colorida
aparecerá na janela de resultados G e/ou M.

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 Dengue IgG/IgM ECO Teste é um teste rápido imunocromatográfico de
fluxo lateral, que detecta anticorpos contra os quatro sorotipos do vírus da
dengue. A tira de teste contida no dispositivo teste consiste em: 1) uma
almofada conjugada, de coloração vermelha, contendo antígeno envelopado
recombinante conjugados com ouro coloidal (dengue conjugado) e IgG de
coelho-ouro conjugado; 2) membrana de nitrocelulose, contendo anti-IgG
humano, uma linha (linha M) e uma linha C controle (linha C). A linha M é
revestida com anti-IgM humano e a linha C é pré-revestida com anticorpo de
cabra anti-IgG de coelho. Quando um volume suficiente da amostra é
dispensado dentro da cavidade da amostra no dispositivo teste, a amostra
migra por ação capilar. Anticorpo IgG anti-dengue, se presente na amostra, se
ligará ao dengue conjugado. O imunocomplexo é então capturado na
membrana pelo anti-IgG humano, formando uma linha de coloração vermelha
na região G, indicando teste reagente para IgG anti-vírus da dengue. O
resultado reagente na linha G sugere uma infecção secundária ou infecções
anteriores.

2 OBJETIVO
2.1 ELISA
 Compreender o princípio do método;
 Executar um ensaio de ELISA indireto seguindo as instruções do kit
fornecido;
 Aplicar os conceitos de boas práticas laboratoriais na execução dos
ensaios.
2.2 Ensaio imunocromatográfico (Teste rápido)
 Compreender o princípio do método;
 Executar dois testes rápidos seguindo as instruções do kit fornecido;
 Aplicar os conceitos de boas práticas laboratoriais na execução dos
ensaios.

3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
- Estantes para tubos e eppendorfs;

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- Micropipetas de volume variável;
- Papel toalha;
- Placas de 96 poços;
- Ponteiras com filtros;
Reagentes
- Água deionizada;
- Álcool 70% v./v.;
- Kit Dia.Pro de imunoensaio enzimático para determinação de anticorpos IgG
em amostras de soro ou plasma. O kit contém:
* Microplaca com 12 strips de 8 poços adsorvida com antígenos do vírus da
Dengue tipos I, II, II e IV;
* Controle negativo - composto por: soro humano diluído negativo para o vírus
da Dengue, caseína 2%, tampão de citrato de sódio 10 mM (pH 6.0 ± 0,1),
Tween 20 0,1%, azida de sódio 0,09% e ProClin 300 0,045% como
preservativo;
* Controle Positivo – composto por: soro humano diluído IgG positivo para o
vírus da Dengue, caseína 2%, tampão de citrato de sódio 10 mM (pH 6.0 ±
0,1), Tween 20 0,1%, azida de sódio 0,09% e ProClin 300 0,045% como
preservativo;
* Tampão de lavagem – Solução concentrada: após diluição, a solução de
lavagem contém de tampão fosfato 10 mM (pH 7.0 ± 0,2), Tween 20 0,05% e
ProClin 300 0,045% como preservativo;
* Conjugado enzimático – Anticorpo policlonal anti- IgG humano conjugado com
peroxidase de rábano, BSA 5%, Tampão Tris 10 mM (pH 6.8 ± 0,1), ProClin
300 0,045% e sulfato de gentamicina 0,02% como preservativos;
* Substrato cromogênico – Tampão citrato de sódio 50 mM (pH 3.5-3.8),
dimetisulfóxido 4%, tetrametilbenzidina (TMB) 0,03% e peróxido de hidrogênio
(H2O2) 0,02%;
* Ácido sulfúrico – Solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,3 M;
* Diluente de amostra – caseína 2%, tampão citrato de sódio 10 mM (pH 6.0 ±
0,1), Tween 20 0,1%, azida de sódio 0,09% e ProClin 300 0,045% como
preservativo.
3.2 Equipamentos
- Estufa (37°C ± 0,5°C);

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- Lavadora de placas;
- Leitora de placas com filtros de 450 nm (amostra) e 620-630 nm (branco);
- Vórtex.
3.3 Procedimentos
3.3.1 ELISA
Cuidados
- Manter a placa em temperatura ambiente antes do início do ensaio por,
aproximadamente, 1 hora;
- Agitar os reagentes em vórtex antes do uso;
- O tampão de lavagem deve ser preparado com água destilada evitando a
formação de espuma. Uma vez diluído (20x), o tampão deve ser usado por até
uma semana e deve ser armazenado a 2-8°C;
- O substrato cromogênico é fotossensível. Dessa forma, deve ser armazenado
em local protegido da luz, longe de agentes oxidantes e superfícies metálicas.
O procedimento foi realizado seguindo as etapas descritas pelo fabricante do
kit:
- Diluir as amostras 1:101 (ex: 1 mL de diluente de amostra e 10 µL de
amostra). Homogeneizar em vórtex;
- Acrescentar 100 µL de controle negativo em triplicata e 100 µL de controle
positivo em uma única réplica;
- Acrescentar as amostras diluídas nos poços previamente identificados em
mapa de placa;
- Selar a placa com o adesivo e incubar a placa a 37°C por 1 hora;
- Lavar a placa em lavadora automática de placa (5 ciclos de lavagem, com a
dispensação de 350 µL de tampão de lavagem, 20 segundos de contato e
aspiração);
- Pipetar 100 µL do conjugado enzimático em cada um dos poços (menos no
poço de branco) e cobrir novamente com o selador. Conferir se todos os poços
receberam o conjugado de coloração vermelha;
- Incubar a placa a 37°C por 1 hora;
- Lavar a placa em lavadora automática de placa;
- Pipetar 100 µL do substrato cromogênico em cada um dos poços, inclusive no
poço de branco. Incubar a placa em temperatura ambiente, no escuro por 20
minutos;

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- Pipetar 100 µL da solução de ácido sulfúrico para interromper a reação
enzimática seguindo a mesma sequência de pipetagem nas etapas anteriores;
A adição do ácido sulfúrico faz com que o controle positivo e as amostras
positivas passem de azul para a cor amarela.
- Medir em leitora de placas a intensidade da cor em cada um dos poços com
os filtros de 450 nm (amostras) e 620-630 nm para subtração do branco.
A leitura deve ser realizada o mais rápido o possível não podendo ultrapassar
20 minutos após a adição do ácido sulfúrico.
3.3.2 Teste rápido
- Fazer a coleta da amostra com uma lanceta, após limpeza com álcool;
- Aplicar a amostra no local indicado pelo fabricante (aproximadamente 10 µL);
- Aplicar 3 gotas (aproximadamente 90-120 µL) do diluente no local indicado
pelo fabricante;
- Aguardar o tempo indicado pelo fabricante (15 minutos);
- Realizar a leitura seguindo as instruções da bula do kit.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ELISA
Após leitura em leitora de placas, a 450 e 620-630 nm, foram obtidos os
seguintes resultados:
Valores de absorbância das amostras a 450 nm:
Amostras Abs
D - 150 2,015
E - 185 1,605
F - 303 0,680
G - 370 3,663
H - 480 1,111

Foi feita a média dos brancos lidos a 620-630 nm e o valor foi subtraído
dos valores das amostras. Após a retirada do background, foi calculado o valor
do cut off = média dos valores de absorbância dos controles negativos + 0,250.

19
Figura 8 Cálculo dos resultados das amostras

Os cálculos dos resultados foram realizados como indicado na Figura 3,

pegando-se o valor da absorbância da amostra, subtraindo o valor da média
dos brancos lidos a 620 nm e dividindo o valor pelo cut off. O ensaio foi
validado uma vez que os valores dos brancos ficaram abaixo de 0,1, os valores
dos controles negativos ficaram abaixo de 0,150 e os valores dos controles
positivos da placa ficaram maior ou igual a 0,500.

Os resultados foram interpretados conforme indicação da bula do kit.

4.2 Teste rápido

O teste de detecção de anticorpos anti-Zika foi realizado com a amostra de
sangue da aluna Paula. Apesar de muito clara, apareceu uma linha indicando
infecção prévia por Zika, pela detecção de anticorpos IgG.

Figura 9- Resultado do teste rápido Zika-vírus

O teste de detecção de anticorpos anti-dengue foi realizado com a amostra de

sangue do aluno Lucas. O teste indicou que o aluno não teve infecção prévia

20
pelo vírus da dengue uma vez que apenas a linha de controle apareceu após
15 minutos.

5 CONSIDERAÇÕES GERAIS
Foi possível identificar resultados positivos, negativos e inconclusivos
com as amostras testadas pelo método de ELISA indireto com a utilização do
Kit Dia.Pro para determinação de anticorpos IgG anti-dengue-vírus. Pelos
testes imunocromatográficos, foi possível obter resultado positivo na amostra
para IgG anti-Zika e resultado negativo no teste rápido de detecção de
anticorpos IgG anti-vírus da Dengue.
Todas as etapas dos protocolos e/ou instruções das técnicas executadas
foram devidamente seguidas, evitando possíveis erros e minimizando riscos de
acidentes e eventuais contaminações.

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BORGES, L.; DEMARGOS, A.; HATANAKA, E., Technical bioanalytical

considerations for detection and quantification of cytokines in ELISA assays
Cytokines, v. 89, 2021.

MS, 2020. Disponível online:

<https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22168/mod_resource/content/
2/HIV%20-%20Manual%20Aula%206%20%281%29.pdf> Acesso em
18/08/2023.

21
Prática 4 – Soroneutralização – Plaque reduction neutralization test
(PRNT)

1 INTRODUÇÃO
O teste de soroneutralização, também chamado de vírus-neutralização, é
utilizado para detectar anticorpos capazes de neutralizar a infectividade de um
determinado vírus. O teste, geralmente feito com amostras de soro, pode ser
realizado com outros fluidos corporais que possuam anticorpos. O objetivo do
ensaio não é apenas o diagnóstico, mas também, epizootiológico uma vez que
ajuda na determinação da prevalência e distribuição de anticorpos contra um
determinado agente patogênico. O soro/amostra é inicialmente incubado com
uma quantidade fixa e conhecido do vírus para qual se está pesquisando
anticorpos. Após período de incubação, a amostra é adicionada ao cultivo celular
suscetível à infecção viral. O cultivo é então monitorado por 5 dias para
avaliação de efeitos citopáticos, como a formação de placas de lise. Se o soro
tiver anticorpos neutralizantes, haverá uma redução proporcional dos efeitos
citopáticos (MIRANDA, 2015).

2 OBJETIVO
2.1 Método da formação de placas de lise
 Observar a formação das placas de lise decorrentes da infecção pelo
vírus da febre amarela e quantificar as partículas virais ao final do
ensaio;
 Observar se houve redução da formação de placas de lise em função de
anticorpos neutralizantes nas amostras;
 Aplicar os conceitos de boas práticas laboratoriais na execução dos
ensaios.

3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
- Estantes para tubos e eppendorfs;
- Frascos para cultura de células;
- Micropipetas de volume variável;
- Papel toalha;
22
- Placas de cultivo celular de seis poços;
- Pipetas sorológicas descartáveis;
- Pipetador automático;
- Ponteiras com filtros;
- Tubos eppendorf;
- Tubos falcon de 15 e 50 mL.
3.2 Reagentes
- Álcool 70% v./v.;
- Linhagem celular Vero CCL-81;
- Meio de cultura CMC 1% (carboximetilcelulose);
- Meio de cultura MEM (Earle);
- Solução de formol 10% e formalina 3,7%
- Solução de cristal violeta 1%;
- Soro fetal bovino (SFB);
- Tampão fosfato-salina (PBS);
3.3 Equipamentos
- Cabine de Segurança Biológica (CSB);
- Estufa;
- Microscópio invertido;
- Vórtex.
3.4 Procedimentos
- Desinfetar a superfície de trabalho da CSB com álcool 70%;
- Expor a superfície sob luz ultravioleta (UV) por 15 minutos;
- As amostras foram previamente inativadas em banho-maria a 56°C por 30
minutos;
- O vírus da febre amarela foi diluído para posterior inoculação em células Vero
CCL-81 previamente cultivadas em placas de 6 poços com 70-80% de
confluência;
- A diluição do vírus foi realizada a partir de uma solução estoque viral a 1,3 x
107 PFU/mL para 1,3 x 105 PFU/mL. O volume total de inóculo foi definido para
todas as amostras, de todos os grupos;
- Diluição das amostras – 50 µL das amostras foram adicionados a 450 µL de
meio MEM a 1% (diluição 1:10). O processo foi repetido duas vezes uma vez
que cada grupo recebeu 2 amostras;

23
- O controle de vírus foi feito com SFB, igualmente diluído 1:20;
- A amostra diluída (500 µL) foi adicionada ao eppendorf com 500 µL da
suspensão viral a 150 PFU/poço (diluição 1:20). O processo foi repetido duas
vezes uma vez que cada grupo recebeu 2 amostras;
- Os 1000 µL de amostra em meio + vírus foram incubados por 1 hora a 37°C;
- O volume de inóculo foi calculado para que, em cada poço, fossem
dispensados 500 µL. No entanto, foram adicionados 400 µL de
amostra+meio+vírus nos poços correspondentes da placa (Figura 1),
dispensando o volume na parede do poço para não prejudicar a confluência
das células. Dessa forma, espera-se ter uma quantidade de PFU/mL (120) um
pouco menor do que o planejado (150 PFU/mL);

7 91

7 91

Figura 10 Mapa da placa do grupo 2 - amostras 7 e 91 em duplicata. Fonte: Erik Reis, 2023.

- Para adsorção dos vírus às células, a placa deve ser incubada por 1 hora à
37ºC em estufa de CO2 e deve ser homogeneizada de 10 em 10 minutos com
movimento em cruz para distribuição uniforme do inóculo em todo o poço;
- Após a retirada do meio MEM, o meio CMC 2% foi acrescentado aos poços
de forma a cobrir uniformemente a monocamada;
- A placa foi incubada por 5 dias a 37°C;
- Após o período de incubação, as placas foram fixadas com aproximadamente
1 mL da solução de formol 10% e formalina 3,7% por 30 minutos. Essa solução
inativa o vírus e fixa as células;

24
- A solução de formol deve ser retirada com cuidado e a lavagem deve ser feita
vertendo-se a água sobre a tampa da placa, de forma a distribuir de maneira
mais homogênea para não danificar a monocamada. A lavagem deve ser
realizada 3 vezes para a completa remoção do meio CMC. Caso o CMC não
seja devidamente retirado, pode prejudicar a leitura uma vez que possui muito
artefato;
- A coloração das placas é realizada com cristal violeta 1% por 10-15 minutos.
O volume aproximado é de 1 mL, o suficiente para cobrir toda a superfície do
poço;
- Após período de coloração, procede-se à contagem das placas de lise.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Conforme pode ser observado na Figura 2, o número de placas de lise

ficou abaixo do esperado com apenas 7 placas formadas no controle de vírus.
Nas réplicas da amostra 7, foram contadas 3 e 9 placas de lise e nas réplicas
da amostra 91, foram contadas 4 e 2 placas de lise, respectivamente. Isso
pode ser explicado pelo tempo em que o vírus ficou fora das condições
apropriadas desde o momento em que a solução estoque foi diluída. Essa
hipótese pode ser confirmada quando se compara o número de placas de lise
obtidas no controle de vírus do professor Erik (31) que foi o primeiro a
plaquear. Ainda assim, o número esperado de 120 PFU/mL não foi alcançado
por nenhum dos grupos. É possível ainda que a titulação inicial teórica de 1,3 x
107 da solução estoque não estivesse correta.
Como a amostra 7 apresentou média do número de placas de lise muito
próxima da do controle de vírus, entende-se que seja uma amostra negativa
para anticorpos neutralizantes. Além de uma das réplicas ter apresentado
número de placas de lise maior do que o poço de controle de vírus houve uma
diferença de 33% entre réplicas, invalidando o ensaio. Para a amostra 91,
houve uma redução de pouco mais de 50% em comparação com o controle de
vírus, se avaliada a média das réplicas. No entanto, existe uma diferença de
50% entre as réplicas, o que, por si só, invalida o ensaio.

25
Figura 11- Placa com amostras e controles. Fonte: Erik Reis, 2023.

Figura 12- Placa modelo - professor Erik Reis. Fonte: Erik Reis, 2023.

26
5 CONSIDERAÇÕES GERAIS

O teste de Neutralização por Redução de Placas de Lise - PRNT é um teste

padrão empregado na avaliação da eficácia vacinal e apresenta, frente a outros
métodos, maior especificidade na detecção e quantificação de anticorpos
neutralizantes. No entanto, o mesmo demanda tempo para a obtenção de um
resultado e pode apresentar variabilidade se as etapas do processo não
estiverem bem estabelecidas e com critérios de aceitação definidos, de modo a
permitir melhor controle do processo.

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

MIRANDA, Emily Hime. Padronização e Validação do teste de Neutralização

por Redução de Placas de Lise em placa de 96 poços para avaliar a
imunogenicidade do componente caxumba da vacina MMR. Dissertação.
FIOCRUZ, 120 p., 2015.

Prática 5 – Extração de DNA/RNA e Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR) (PRNT)

1 INTRODUÇÃO
A extração de ácidos nucleicos fornece importantes informações sobre a
expressão gênica de amostras biológicas: soro, plasma, sangue total, swabs de
orofaringe e nasofaringe, amostras ambientais e lavado bronco-alveolar. Os
métodos para isolamento de RNA baseiam-se na lise e na desnaturação das
células o que permite a liberação dos ácidos nucléicos totais na presença de
inibidores que impedem a ação de RNAses, uma vez que a principal dificuldade
na extração de RNA é a alta presença de RNAses ativas que rapidamente
degradam o RNA. Desta maneira, a primeira etapa em todos os métodos de
isolamento de RNA é a exposição deste material a tampões de extração. Estes
apresentam substâncias como o cloreto de lítio que auxilia a precipitação do
RNA e isotiocianato de guanidina que permite a conservação do RNA intacto
nas etapas seguintes da extração, por meio da degradação das RNAses
endógenas (SAMBROOK, 2002). Além disso, a segurança de um local

27
exclusivo para manipulação de RNA, com luvas, ponteiras e reagentes livres de
RNAse ou DNA exógeno garantem o sucesso da extração.
Uma das aplicações para a extração de RNA total é para reação em
cadeia da polimerase (PCR). Esta técnica molecular, criada na década de 80,
permite multiplicar seguimentos específicos de ácido nucléicos in vitro para fins
de detecção qualitativa e/ou quantitativa. Geralmente, os reagentes básicos
para realização de uma PCR são um par de primers (forward e reverse) que
irão hibridizar o DNA molde, também chamado de alvo ou template,
desoxirribonucleotídeos (dNTPs) que serão a matéria-prima da nova cadeia de
DNA sintetizada, solução tampão contendo MgCl2 e as enzimas Taq DNA
polimerase – uma enzima termoestável responsável pela amplificação da
cadeia de DNA iniciada pelos primers – e transcriptase reversa que será
responsável por sintetizar DNA (cDNA) a partir de um template de RNA.
Para um ótimo funcionamento, a PCR depende de ciclos termoestáveis
para que possa ocorrer suas 3 etapas fundamentais. A etapa de desnaturação
do DNA, onde suas ligações de hidrogênio serão rompidas separando as fitas
duplas, geralmente ocorre a 94ºC. A etapa de anelamento representa a
temperatura ótima para que os primers hibridizem o DNA molde. A etapa de
extensão é a temperatura específica para ativação da Taq polimerase e
extensão da nova cadeia de DNA.
Outro ponto importante é que enquanto a PCR convencional só pode ser
avaliada quanto o seu desempenho após o fim da reação, a PCR em tempo
real (qPCR) pode ser acompanhada durante a ocorrência dos ciclos de
amplificação. Graficamente, podemos dizer que a qPCR possui 3 fases, a fase
exponencial, a fase linear e a fase platô e estas fases podem ser detectadas
pela adição de sondas que emitem fluorescência, a exemplo da sonda TaqMan
que se liga ao DNA alvo até ser separada pela ação da Taq polimerase, ocorre
o rompimento da ligação quencher-reporter, e posterior emissão da
fluorescência. A RT-PCR pode ser do tipo One step, quando a síntese de
cDNA e a amplificação do cDNA ocorrem simultanemente, diminuindo as
chances de contaminação e degradação das amostras. E do tipo Two steps,
onde primeiro ocorre a síntese de cDNA e depois a PCR. Na PCR Two steps o
cDNA apresenta maior estabilidade para a amostra, contudo, há uma maior
manipulação e um tempo maior para conclusão da reação.

28
 A PCR pode ainda ser do tipo multiplex, quando mais de um seguimento
de DNA é amplificado e do tipo nested, quando um seguimento de DNA é
amplificado e um segundo seguimento menor, contido no primeiro seguimento,
é amplificado.

2 OBJETIVO
2.1 Extração de ácido nucleico
 Extração de RNA total das amostras biológicas 292 e 298 para pesquisa
de RNA viral utilizando o kit QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN);
 Evitar contaminação ou perda quantitativa do material extraído;
 Aplicar os conceitos de boas práticas laboratoriais na execução dos
ensaios.
2.2 qPCR
 Realização de RT- qPCR para ZIKV (One step);
 Evitar contaminações cruzadas;
 Aplicar os conceitos de boas práticas laboratoriais na execução dos
ensaios.

3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais e Reagentes
• Reagentes do kit de extração;
• Microtubos de 1,5 mL;
• Colunas do kit Qiagen;
• Tubos coletores;
• Racks;
• Pincel marcador permanente;
• Descartes (líquido, sólido);
• Ponteiras para pipetas de 200uL e 1000uL;
• Etanol MERCK PA (100%)
• Estantes para tubos e eppendorfs;
• Micropipetas de volume variável;
• Papel toalha;
• Ponteiras com filtros.

29
3.2 Equipamentos
- Cabine de Segurança Biológica (CSB);
- Equipamento de PCR;
- Vórtex.
3.3 Procedimentos
- Desinfetar a superfície de trabalho da CSB com álcool 70%;
- Expor a superfície sob luz ultravioleta (UV) por 15 minutos;
1. Descongelar o AVL (sem cristais);
2. Adicionar 140 μL de amostra no microtubo contendo 560 μL de AVL;
3. Vortexar por 15 segundos e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos;
4. Dar spin nos microtubos;
5. Adicionar 560 μL de etanol no microtubo e vortexar por 15 segundos (USAR
UMA PONTEIRA PARA CADA TUBO; PONTEIRAS COM FILTRO);
6. Dar um spin nos microtubos;
7. Colocar 630 μL da mistura amostra / AVL / etanol na coluna do kit;
8. Centrifugar a 6000 x g por 1 minuto;
9. Passar a coluna para outro tubo coletor vazio e repetir o passo anterior
(colocar 630 μL de amostra) (USAR PONTEIRA COM FILTRO);
10. Centrifugar a 6000 x g por 1 minuto;
11. Passar a coluna para outro tubo coletor;
12. Adicionar 500 μL de buffer AW1 na coluna (contém guanidina) (USAR UMA
PONTEIRA PARA CADA TUBO; USAR PONTEIRA SEM FILTRO);
13. Centrifugar a 6000 x g por 1 minuto;
14. Colocar a coluna em um novo tubo coletor;
15. Adicionar 500 μL de buffer AW2 (USAR UMA PONTEIRA PARA CADA
TUBO; USAR PONTEIRA SEM FILTRO);
16. Centrifugar por 3 minutos na velocidade máxima (16.000 X g);
17. Trocar o tubo coletor da coluna.
18. Centrifugar novamente por 1 minuto, na velocidade máxima;
19. Colocar a coluna no tubo de 1,5 ml devidamente identificado;
20. Eluir em 60 μL do buffer AVE ou H2O RNAse free;
21. Incubar por 10 minutos;
22. Centrifugar por 1 minuto à 6000 x g;

30
23. Descartar a coluna e armazenar o tubo contendo o RNA em um freezer à -
80°C ou utilizar imediatamente (recomendado).

3.4 qPCR

Figura 13 Mapa da placa para qPCR, configuração do ciclo de amplificação e composição do Mix com
sonda TaqMAN. Fonte: Ana Sttofella, 2023.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

31
A amostra AM1 foi a única amostra positiva com ciclo ct entre 16 –18.

Figura 14- Gráfico da amostra positiva AM1 e sua réplica. Fonte: Ana Sttofella, 2023

Curiosamente, a outra réplica de AM1 não apresentou positividade, como mostrado na

Figura 3.

32
Figura 15- Gráfico da amostra negativa AM1 e sua réplica positiva. Fonte: Ana Sttofella, 2023.

Os controles da placa (NTC) apresentaram o comportamento esperado sem

amplificação.

Figura 4 - Gráfico das réplicas NTC. Fonte: Ana Sttofella, 2023.

Os controles positivos apresentaram uma típica curva de amplificação

com ct por volta de 28 – 30.
Analisando a amostra positiva e o controle positivo pode-se dizer que a
amostra AM1, dos poços A4 e B4, possui um maior conteúdo viral uma vez que
sua amplificação iniciou-se antes, indicando maior conteúdo de RNA alvo na
amostra.

33
Figura 5 - Gráfico das réplicas dos controles positivos. Fonte: Ana Sttofella, 2023.

Representação das atividades inespecíficas das amostras 292, 298, 288,

315, 313, 300, 308, 304, 312, 311 e o controle negativo.

Figura 6 - Gráfico das amostras negativas. Fonte: Ana Sttofella, 2023.

34
5 CONSIDERAÇÕES GERAIS
 Reagentes que contêm guanidina devem ser descartados
separadamente e identificados;
 Dependendo da prática, os tubos coletores podem ser reutilizados;
 A padronização de uma técnica de PCR envolve inúmeros fatores como
a qualidade dos primers para não formarem dímeros ou hairpins, a
purificação do conteúdo do DNA alvo, concentrações de dNTPs
interferem na ação dos primers e presença de inibidores da Taq
polimerase, como o EDTA, hemoglobina, SDS e fenol.

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Adaptado de QIAamp® Viral RNA Mini Handbook. QIAGEN, 2020. Disponível

em <https://www.qiagen.com/us/products/diagnostics-and-clinical-
research/sample-processing/qiaamp-viral-rna-kits?catno=52906>.

SAMBROOK, J.; RUSSELL, D.W. Molecular cloning: a laboratory manual

(trans: Huang PT). China Science Press, Beijing, 2002.

IBELLI, Adriana Mércia Guaratini; DE ALMEIDA REGITANO, Luciana Correia;

MÉO, Simone Cristina. 3. EXTRAÇÃO DE RNA. 2007.

BOTELHO, I. PCR, REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE. Disponível em:

<PCR_curso_verao_2013.ppt (ufsc.br)>. Acesso em: 13 setembro 2023.

BUSTIN, Stephen A. et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for

Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. 2009.

35