Laboratórios integrados I

Índice

TÉCNICA DE CULTURA DE CÉLULAS MICROBIANAS.........................................................................1

ESTERILIZAÇÃO.............................................................................................................................1
MEIO DE CULTURA........................................................................................................................2
TRANSFERÊNCIA EM MEIO SÓLIDO...............................................................................................3
MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO DE CÉLULAS................................................................................4
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR POR TURBIDIMETRIA.............................................5
MÉTODO DE CONTAGEM DE COLÓNIAS FORMADAS..................................................................6
MÉTODO DE CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO..................................................................6
CINÉTICA DE CRESCIMENTO..........................................................................................................7
TÉCNICA DE SEPARAÇÃO DE BIOPRODUTOS.....................................................................................9
ULTRAFILTRAÇÃO/HEMOFILTRAÇÃO............................................................................................9
RUTURA CELULAR.........................................................................................................................9
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE................................................................................................10
ELETROFORESE (SDS-PAGE).....................................................................................................11

Laboratórios integrados I | 07-01-2018

1
 Técnica de Cultura de Células Microbianas

Esterilização
A preparação e cultura de células microbianas em laboratório requer condições ambientais controladas.
Assim, é necessário recorrer à esterilização de todos os materiais utilizados, de modo a eliminar completamente
todos os microrganismos nas suas mais variadas formas vegetativas (esporos, bactérias, fungos).
Existem diversas formas de esterilização possíveis que permitem atingir as condições ideais para a cultura
de células microbianas, sendo que a escolha da técnica utilizada depende da natureza dos materiais a serem
esterilizados.

Meio de Cultura
Os meios de cultura devem ser escolhidos conforme o tipo de célula que se pretende cultivar, uma vez
que, têm que promover o seu crescimento in vitro e satisfazer os seus requisitos nutricionais, contendo os
nutrientes indispensáveis sob forma assimilável. Contudo, para assegurar a sobrevivência e o suporte de vida dos
microrganismos, estes nutrientes têm que estar presentes em quantidades não tóxicas e, consequentemente, não
limitantes ao seu crescimento. Para além das necessidades nutritivas, vários outros fatores ambientais precisam
de ser controlados para o sucesso da cultura dos microrganismos, como sejam o pH, a temperatura, o ambiente
gasoso ou a pressão osmótica.
Os meios de cultura podem-se encontrar no estado líquido (caldo nutritivo), sólido ou semissólido.
Quando se adiciona um agente solidificante, por exemplo agar, a um meio líquido obtém-se um meio sólido ou
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

semissólido.
O agar é muito adequado como agente solidificante porque se liquefaz a 100 oC e solidifica a 40 oC. Um
meio de cultura bem solidificado exige uma concentração de agar da ordem dos 15 a 20 g/L. Uma concentração
inferior a 1% resulta num meio semissólido.

Um meio rico e complexo para a cultura de leveduras é o meio YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose)
que é composto, tal como o nome indica, por extrato de levedura, peptona e dextrose. É possível ainda adicionar
agar a este meio tornando-o sólido, passando este a designar-se por YEPDA (Yeast Extract Peptone Dextrose

2
Agar). Este meio é excelente para o crescimento de leveduras, uma vez que lhes fornece todos os nutrientes
necessários.

Meio YEPD para leveduras (250 mL = 0,25 L)

 Peptona 20 g/L ⇒ 20 g/L * 0,25 L = 5g
 Extrato de levedura 10 g/l ⇒ 10 g/L * 0,25 L = 2,5g
 Glucose 20 g/L ⇒ 5g
 Acertar a pH 5.5 com NaOH 1 N e HCl 1 N

Preparação
 Pesar os reagentes na balança digital (±0,01)
 Medir 250mL de água destilada na proveta e juntar aos reagentes
 Agitar com a vareta e transferir para um matraz
 Acertar o pH, adicionou-se HCl: pH final = 5,66
 Adicionar 5 g de agar
 Levar o matraz ao micro-ondas: 3 min na potência máxima e 1 min na potência média
 Encher 4 tubos de ensaio com meio de agar com cerca de 8 mL. Fechar com tampa metálica
 Fechar o matraz sem apertar completamente a tampa
 Autoclavar os meios e os tubos em autoclave a 121 oC durante 15 min
 Retirar da autoclave os meios a uma temperatura superior a 42 oC
 Na Câmara de Fluxo Laminar verter, aproximadamente 20 mL de meio em cada placa (meia altura) evitando a
formação de bolhas de ar
 Marcar as placas de Petri contendo meio YPDA e os tubos de agar inclinado (grupo, curso, data, operador...)
 Deixar as placas na caixa de fluxo laminar e os tubos de ensaio na bancada deitados sobre uma vareta
 Deixar arrefecer e solidificar e guardar a 4 oC.

Transferência em Meio Sólido

Existe a necessidade de transferir os microrganismos de um meio de cultura para outros, desde culturas
de armazenamento e manutenção para culturas de análise, para o isolamento de culturas puras ou para a
expansão da massa de microrganismos. O processo de subcultura que tem de necessariamente ser efetuado com
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

técnica asséptica para evitar potenciais contaminações. Todo o procedimento deve ser efetuado sobre a bancada
desinfetada. As manipulações devem ser conduzidas perto do bico de Bunsen que deve arder com chama de cor
azul ou numa câmara de fluxo laminar. Todo o material necessário deve estar colocado na bancada de forma
acessível ao operador.
Tipicamente os passos a seguir para transferir uma cultura são os seguintes:
 Esterilizar a ansa à chama;
 Abrir e passar na chama o bocal do recipiente que contém a cultura;
 Recolher cultura e transferir para meio fresco;
 Esterilizar à chama os bocais dos recipientes e fechá-los;

3
  Esterilizar a ansa no final.
As culturas de células em meios sólidos em tubo com agar inclinado ou em placa de Petri permanecem
viáveis por várias semanas, se forem conservadas a 40
o
C. Contudo, para manter as culturas viáveis é
necessário realizar o processo de subcultura,
transferindo as culturas para meios frescos.
A técnica mais utilizada para transferir uma
amostra de uma cultura para um novo meio, designa-se
por sementeira por riscado. Esta transferência pode-se
realizar utilizando uma das diferentes técnicas de
riscado existentes sendo que inicialmente as células vão
ficar muito juntas, mas ao longo do riscado o número de
células vai diminuir, dando origem a colónias cada vez
mais afastadas.

Métodos de Quantificação de Células

A quantificação do número de células presentes numa suspensão de células é uma técnica muito
importante em microbiologia. Os métodos de quantificação de biomassa podem ser classificados em métodos
diretos e métodos indiretos.
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

4
Aval i ação d a con cen tração cel u l ar p or tu rb id i metri a
O método da turbidimetria baseia-se na relação entre a concentração de células e a turbidez ou densidade
ótica de uma suspensão de células. A lei de Lambert-Beer, demonstra que quando um feixe de luz incidente
atravessa uma suspensão de microrganismos, sofre uma diminuição de intensidade proporcional à concentração
de células em suspensão:
A=K × C =K×C
– Absorvência da suspensão
C – Concentração celular da suspensão
K – Coeficiente de absorção

Este método pode ser realizado rapidamente, contudo podem surgir erros devido a problemas de
calibração e interferências que possam ocorrer, como, por exemplo, bolhas de gás e agregação de células.

Procedimento
 Montar o sistema de filtração (já estava montado)
 Colocar 5 membranas estéreis sobre uma folha de alumínio e pesá-las
 Retirar três amostras de 5 ml da suspensão celular (S. cerevisiae)
 Filtrar individualmente as três amostras de 5 mL, lavando a biomassa retida no filtro com 15 mLl de
água destilada
 Preparar o branco em duplicado, filtrando 20 mL de água destilada por cada membrana
 Colocar as membranas sobre a folha de alumínio e proceder à secagem numa estufa a 80 ºC durante
toda a noite
 Pesar as membranas depois de as deixar arrefecer num exsicador para evitar adsorção de vapor de água.
Calcular o peso médio da suspensão e descontar o peso médio dos controlos
 Calcular o peso seco (g/L) da suspensão celular original
Peso médio da suspensão−Peso médio do controlo
Peso Seco da suspensão original= es
Volume da suspensão
o Seco da suspensão original=Peso médio da suspensão - Peso médio do controlo /Volume da
suspensão
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

 Da suspensão celular original fazer uma leitura preliminar no espectrofotómetro a 630 nm e fazer
diluições (em eppendorfs) de modo a possibilitar a construção de uma curva padrão
 Medir a absorvência das diluições feitas da suspensão
 Calcular o peso seco (g/L) das diluições, com base no valor obtido para a amostra
Peso Seco da diluição=Peso Seco da suspensão original× Fator de diluição eso Seco da
diluição=Peso Seco da suspensão original×Fator de diluição

5
  curva padrão tendo nas abcissas os valores do peso seco em g/L e nas ordenadas os valores da
absorvência.

Métod o d e con tagem d e col ón i as formad as

O método da contagem de colónias baseia-se no princípio de que cada célula viável vai dar origem a uma
colónia e consiste em contar as colónias desenvolvidas em placa de agar após inoculação da suspensão. No
entanto, uma colónia pode-se desenvolver a partir de um grupo de organismos e não de uma célula única, pelo
que, o resultado do número de células obtidas com este método pode ser inferior ao número real. Assim, deve-se
calcular o número de unidades formadoras de colónias (CFU) recorrendo à fórmula:
CFU nº médio de colónias por placa ×inverso da diluição
=
ml Volume de suspensão

A realização desta técnica é bastante rápida e exige pouco equipamento, mas apenas se deve realizar a
contagem das placas que apresentem entre 30 a 300 colónias.

Procedimento
 colocar 0.9 ml (900 µl) de solução salina esterilizada em 7 eppendorfs devidamente rotulados

 recolher assepticamente 0.1ml da suspensão celular para o 1º eppendorf

 fechar o eppendorf e agitar

 transferir 0.1 ml (100 µl) de suspensão do 1º eppendorf

para o 2º e repetir o procedimento até ao 7º eppendorf
 colocar uma ponta estéril na micropipeta e retirar 100 µl do
1º tubo para uma placa com meio YEPD
 molhar o espalhador em álcool e esterilizar com chama (usou-se um espalhador esterilizado dentro da caixa de fluxo
laminar)
 deixar arrefecer e espalhar a gota de suspensão celular sobre a placa

 repetir o procedimento para as restantes diluições

Laboratórios integrados I | 07-01-2018

 incubar a 30ºC colocando a placa na posição invertida, durante 24-48 h;

 depois da incubação prescrita, selecionar as placas que contenham 30 a 300 colónias para a contagem e rejeitar as
restantes placas
 calcular o número de colónias presentes na suspensão utilizando formula acima

Métod o d e Con tagem di reta ao mi croscóp i o

O método da contagem por observação direta ao microscópio é preciso, mas é
estatisticamente questionável a não ser que sejam realizadas muitas observações. Para

6
realizar a contagem do número de células ao microscópio utiliza-se a câmara de Neubauer que é uma lâmina
grossa, geralmente em vidro, que se encontra dividida em 9 retículos, oito laterais e um central interno. Este
retículo central encontra-se dividido em 25 quadrados mais pequenos com 0,2 mm de lado, que, por sua vez, se
encontram divididos em 16 quadradinhos mais pequenos com 0,05 mm de lado. Para obter o total de leveduras
vai-se realizar a contagem nos 5 quadrados marcados com X e para obter a concentração celular (Células/ml)
Células 4
utiliza-se a Equação: =total ×5 × 10 ×inverso da diluição
ml

Cinética de Crescimento

Concentração
versus tempo

A fase de latência (lag), resulta do facto das células transferidas de um meio antigo para um meio
fresco não crescerem de imediato. Esta fase de adaptação celular às novas condições do meio depende de vários
fatores, tais como, a idade e fenótipo do inóculo, condições ambientais (temperatura, arejamento) e composição
dos meios. A taxa específica de crescimento (µ) é próxima de zero.
  Passada a fase de latência, as células começam a crescer rapidamente, entrando na fase exponencial ou
logarítmica. Nesta fase a maioria das células encontram-se no mesmo estado fisiológico. A velocidade de
crescimento nesta fase é proporcional à concentração de células (X) em cada instante, sendo a constante de
dX
proporcionalidade igual à taxa especifica de crescimento, isto é, =μX . Integrando esta equação, obtêm-se a
dt
equação do tipo exponencial que descreve a variação da concentração de células com o tempo na fase
exponencial de crescimento, X =X 0 e , onde X 0é a concentração de células no tempo inicial. A partir desta
μt

ln 2
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

equação define-se tempo de duplicação celular (td) como td= dln2/μ. O tempo de duplicação de uma
μ
cultura depende também de fatores tais como o arejamento e a composição do meio (o td da S. cerevisae em
meio mínimo é o dobro do valor em meio YEPD).
Para avaliar o crescimento das células, também, é possível calcular o rendimento de quantidade de células
∆ X Xf − Xi ❑
produzida por substrato consumido (YX/S): YX/S ¿ = = , sendo S é a concentração de substrato e
∆ S Sf −Si qs
qs a taxa específica de consumo de substrato.

7
 À medida que os nutrientes no meio se esgotam e que se vão acumulando produtos inibitórios ao
crescimento, o crescimento celular vai retardando e eventualmente para, e a cultura entra na fase estacionária de
crescimento. Nesta fase, existem células ainda a dividir-se e a crescer enquanto outras já estão em fase de morte.
  Quando o número de células a morrer excede o número de células a crescer, a cultura encontra-se na
fase de decaimento ou morte.

Procedimento
(No dia anterior à tarde)
 Inocular com uma ansa de cultura os 20 mL de meio
 Incubar com agitação à temperatura ótima durante a noite

(no dia de manhã)

 Transferir assepticamente a subcultura para o 180 mL de meio fresco
 Retirar assepticamente uma amostra (amostra inicial) cerca de 3 mL de cultura
 Medir o pH
 Ler absorvência a 630 nm para determinar a concentração de células
 Contar o número de células ao microscópio e determinar nº Cel/mL (Diluir com água destilada ou
solução salina se necessário)
 Centrifugar a amostra e filtrar o sobrenadante, procedendo à análise dos açúcares redutores pelo
método de DNS (em anexo)
 Incubar à temperatura pretendida com agitação
 Repetir o passo anterior ao longo do tempo de hora em hora
 No final da experiência as culturas e todo o material usado devem ser esterilizados em autoclave antes de
serem rejeitados.
 
(Nota: caso não seja possível efetuar as determinações imediatamente a seguir à recolha da amostra, pode-se
recolher a amostra em tubo estéril, mergulhar no gelo 2 min, e colocar a 4 ºC até ao momento da análise).

  Para construir a curva de crescimento mede-se a absorvência da suspensão ao longo do tempo e faz-se a
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

contagem direta ao microscópio do número de células. Com a curva de calibração da absorvência versus peso
seco descobre-se a concentração (g/L), não esquecendo que caso se tenha feito uma diluição tem de se
multiplicar o valor da concentração obtida pela reta pelo inverso do fator de diluição. Dessa forma já se consegue
construir a curva de crescimento da concentração versus tempo.
Usando apenas os valores que correspondem à fase de crescimento obtém-se um gráfico do tipo
μt
X =X 0 e , a partir do qual se descobre a taxa de crescimento. Sabendo a taxa de crescimento já se pode
calcular o tempo de duplicação.

8
 Para construir a curva da concentração de substrato ao longo do tempo mede-se a absorvência do
sobrenadante ao longo do tempo e com a curva de calibração de DNS descobre-se a concentração e assim
constrói-se a curva da concentração de substrato versus tempo.
∆X
Calcula-se o rendimento (YX/S) pela fórmula YX/S ¿ e a taxa específica de consumo de substrato
∆S
❑
(qs) calcula-se pela fórmula YX/S ¿ . O número de gerações corresponde ao tempo da experiência sobre o
qs
tempo de duplicação.
Na curva do pH, este vai diminuindo ao longo do tempo. Esta diminuição pode dever-se ao
metabolismo/atividade da levedura que vai produzindo produtos que vão fazer diminuir o pH (H + e CO2).

Técnica de Separação de Bioprodutos

Ul trafi l tra ção/ H emofi l tra ção

A ultrafiltração é um processo de separação de partículas presentes numa solução ou suspensão,
dependendo do seu tamanho.
A ultrafiltração consiste numa membrana por onde passa a solução sob a ação de uma pressão aplicada.
A membrana possui poros de uma determinada dimensão e apenas as partículas de tamanho inferior aos poros
conseguem atravessar a membrana, enquanto que partículas de tamanho superior ficam retidas à sua superfície.
Normalmente, a membrana é caracterizada pelo cut-off, que indica o peso molecular máximo das partículas que
conseguem atravessar a membrana. Por exemplo, se a membrana retém solutos com um peso molecular superior
a 10 kDa, apenas os solutos com peso molecular inferior a este valor vão conseguir atravessar a membrana.
Sabendo que a ureia apresenta um peso molecular de 60,06 Da, a glucose apresenta um peso molecular de
180,16 Da e a BSA apresenta um peso molecular de 66,5 kDa, conclui-se que tanto a ureia como a glucose vão
conseguir atravessar a membrana, enquanto que a BSA vai ficar retida na sua superfície.
A ultrafiltração pode operar de forma contínua ou descontínua. Na forma descontínua, o concentrado é
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

recirculado para o tanque de alimentação até o produto final desejado ser obtido. Este é o modo mais rápido de
concentração e o que requer a menor área de filtração. No decurso da operação em descontínuo, o fluxo vai
decrescendo devido ao aumento da concentração da alimentação recirculada. Ocorre, ainda, o fenómeno da
polarização (aumento da concentração de solutos à superfície da membrana que faz baixar o fluxo por efeito
sobre a pressão osmótica). Por este facto, no projeto de unidades de UF deve ser utilizado um fluxo médio
estimado pela equação J m =¿ J f +0,33 ×(J i −J f ).
Outro fator que também diminui o fluxo é o fouling, que é um processo irreversível relacionado com a
frequência do uso da membrana. Durante a filtração algumas partículas ficam retidas nos poros da membrana, o
que diminui a capacidade de filtração da membrana.

9
 Permeado final
Eficiência ( % ) = ×100 ficiência %= Permeado final/Alimentação inicial×100
Alimentaçãoinicial

Ru tu ra Cel u l ar
A rutura celular é essencial para a recuperação de produtos que são produzidos no interior das células e não
são segregados para o seu exterior. Durante este processo é importante ter em conta a associação da molécula de
interesse a outros componentes celulares, a possível degradação enzimática, a eventual presença de contaminantes
que influenciem o desempenho das etapas subsequentes de purificação ou que afetem a atividade biológica. Existem
essencialmente dois tipos de métodos para a rutura celular: métodos mecânicos e químicos. Neste trabalho abordou-
se a utilização de dois métodos mecânicos, um com recurso a ultrassons e outro com esferas de vidro para a posterior
obtenção da proteína de interesse [3].
A rutura celular por sonicação consiste na aplicação de ondas ultrassónicas, de alta frequência que
desestabilizam a parede celular das células. Depende de alguns fatores como a intensidade e o tempo de exposição ao
ultrassom e em grande escala o seu uso é limitado, devido à necessidade de utilização de uma grande quantidade de
sondas ultrassónicas, assim como um sistema de refrigeração eficiente.
A rutura com esferas de vidro provoca a rutura celular através do choque de esferas com as células.
Depende de vários parâmetros, como o tamanho e quantidade de esferas, o tempo de residência, a velocidade de
agitação, o tipo de microrganismo, a concentração da suspensão celular e as forças de cisalhamento. O tamanho
ótimo das esferas de vidro está relacionado ao tamanho dos microrganismos produtores da enzima de interesse.
Esferas de diâmetro entre 0,10-0,15 mm são indicadas para a rutura de células bacterianas; enquanto que esferas
entre 0,50-0,75 mm de diâmetro favorecem a rutura de leveduras.
A avaliação do grau de rutura é bastante importante na análise da eficiência do processo de
desintegração. O grau de rutura pode ser expresso de forma direta através da percentagem de células
desintegradas por observação microscópica ou de forma indireta pela quantificação da fração de proteína
libertada. Uma outra forma de avaliar a eficiência do processo de rutura é o doseamento da substância que se
pretende obter.
Após a utilização do método de rutura centrifugou-se a suspensão e utilizou-se o sobrenadante para
fazer o doseamento da proteína através do método de Bradford, isto é, mediu-se a absorvência da suspensão e
através da curva de calibração de BSA previamente construída descobriu-se a concentração da proteína. De
seguida, calculou-se a taxa de rutura para cada ensaio.
Ci
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

Taxa de rutura= ×100 axa de rutura=C_i/C_máx ×100

C máx
A proteína utilizada foi uma endolisina. Estas proteínas degradam a parede celular das bactérias, pelo
que para medir a atividade da proteína usou-se uma suspensão bacteriana à qual se adicionou a proteína e se
mediu a absorvência. Como a endolisina provoca uma diminuição do número de células bacterianas na
suspensão, a absorvência vai diminuindo ao longo do tempo.
Para saber o valor exato da variação da absorvência calculou-se a diferença entre a absorvência inicial
(0 min) e a final (75 min) e também se calculou a velocidade da reação a partir do declive da reta de ajuste dos
dois pontos iniciais (0 e 15 min) para cada ensaio

10
Cromatog rafi a d e afi n id ad e
Baseia-se em interações biológicas específicas entre duas moléculas. Na passagem por uma coluna
cromatográfica as proteínas com afinidade com a fase estacionária estabelecem ligações e ficam aderidas e as
restantes vão sair. Posteriormente, é necessário separar a proteína da fase estacionária, por eluição, passando na
coluna uma solução com uma substância com uma maior afinidade para a fase estacionária do que a proteína.
A técnica cromatográfica que vão realizar é muito comum na separação/purificação de proteínas
recombinantes com uma cadeia de histidinas no terminal C ou terminal N da proteína. Esta técnica baseia-se na
afinidade que existe entre o níquel bivalente (Ni2+) e proteínas com resíduos de histidina. A fase fixa é composta
por uma resina que pode ser agarose ou sefarose que após condicionada com ácido nitrilotriacético estabelece
ligações covalente com o níquel que fica assim fortemente ligado à resina. Quando uma mistura de proteínas é
introduzida na coluna, as proteínas com resíduos de histidina ligam-se ao Ni2+ e as restantes saem da coluna.

E l etrofor ese (S DS -PAG E )

Uma técnica usada para separar moléculas com carga elétrica de acordo com o seu peso molecular. Tem
múltiplas vantagens, como a sua simplicidade de execução, o facto de não ser tóxico e, ainda, permitir uma
ampla gama de separação.
A velocidade de migração da molécula vai depender de vários parâmetros, como o pK dos grupos
carregados, o pH, a temperatura, a força iónica, a concentração de sais da solução e o tamanho. A migração em géis de
agarose também é afetada pela escolha do buffer de operação e da tensão aplicada.
padrã inici C C C C C
o al 1 2 3 4 5
kD
a96
66

48
40

32

26
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

Na faixa da amostra inicial, verifica-se que se formam muitas bandas, uma vez que esta amostra para
além da proteína de interesse, contém um conjunto de proteínas resultantes do metabolismo celular que
apresentam pesos moleculares diferentes e daí a formação das diversas bandas. Verifica-se também a formação
de uma banda mais intensa, que corresponderá à proteína de interesse.
Na faixa de C1, observa-se uma diminuição do número de bandas, uma vez que algumas das proteínas
ficaram aderidas quando a amostra inicial foi colocada na coluna cromatográfica. Para além disso verifica-se que

11
 não ocorre a formação de uma banda mais saliente correspondente à proteína de interes-se, pois esta ficou
aderida à coluna cromatográfica e por isso não é eluída na amostra C1.
Em C2 praticamente não é observada nenhuma banda, uma vez que esta amostra resulta apenas da
lavagem da coluna com tampão e por isso as proteínas continuam aderidas.
Observa-se que em C3, C4 e C5 se forma uma banda na mesma zona do gel, que corresponde à proteína
de interesse. Com uso da solução de imidazol, as proteínas que estavam aderidas, vão sendo eliminadas da
coluna, devido à maior afinidade do imidazol com o níquel que então vai competir com a proteína para ficar
aderido à coluna. Após aplicação de imidazol com 50 mM apenas algumas das proteínas que é que são
eliminadas, podendo-se concluir que esta concentração de imidazol não é suficiente para fazer eluir a proteína.
Para uma concentração de imidazol de 150 mM, a banda que se forma é mais intensa, indicando que com esta
concentração de imidazol ocorre maior eluição da proteína da coluna cromatográfica.
Para saber o peso molecular da proteína de interesse tem de se construir uma curva de calibração log
(peso molecular) versus razão da distância através do padrão, sendo que a razão da distância é igual à razão entre
a distância de migração da proteína e a distância de migração da frente do corante.
A razão da distância pode ser calculada, utilizando uma régua para medir ambas as distâncias. Como já
se tem a razão da distância, com a curva de calibração descobre-se o log (peso molecular)
Laboratórios integrados I | 07-01-2018

Medindo a absorvência das diferentes amostras e utilizando o método de Bradford consegue-se calcular
a concentração da proteína, que se multiplica pelo volume utilizado para obter a respetiva massa.
Os valores da massa são utilizados para calcular o rendimento de recuperação que é igual à soma da massa de c3,
c4, c5 (amostras em que a proteína eluiu) a dividir pela massa da amostra inicial.
Massa das amostras emque a proteína eluiu
Rendimento de Recuperação= × 100endimento de
Massa da amostra imicial
Recuperação=Massa das amostras em que a proteína eluiu/Massa da amostra imicial×100
.

12
Notas:
 Após aplicar o gel entre os vidros adiciona-se algumas gotas de água ultrapura, de forma a impedir a
entrada de O2, para que a polimerização do gel seja mais rápida
 Antes de aplicar as amostras no gel elas são incubadas para que as proteínas desnaturem, para que a sua
geometria não afete a migração no gel.

Laboratórios integrados I | 07-01-2018

13