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Universidade Nova de Lisboa

Instituto de Tecnologia Qumica e Biolgica

Relatrio Laboratorial: Estudo comparativo de cultura de clulas de


mamfero e de insecto: mtodo directo da avaliao do crescimento e da
viabilidade

Ano lectivo: 2014/2015

Trabalho realizado por: Grupo 4

Unidade Curricular: Biofrmacos

Diogo Almeida, n 44848

Investigadores: Hugo Soares e


Daniel Simo

Joana Bastos, n 45885


Joana Mota, n45907
Margarida Ferreira, n 44815

15 de Outubro de 2014

Introduo
Na maioria dos procedimentos biolgicos que envolva cultura de clulas a avaliao da
viabilidade da cultura um procedimento imprescindvel, isto , identificar as clulas que
apresentem atividade metablica.
Neste trabalho prtico foi utilizado um mtodo direto de contagem de clulas
utilizando um hemocitmetro e usando a tcnica de excluso por azul tripano. O composto
utilizado um corante de tom azul que utilizado especialmente em ensaios que permitam
avaliar a viabilidade das clulas em cultura. As clulas que possuam uma membrana celular
intacta no permitem a passagem do azul tripano para o seu meio intracelular. Nas clulas em
que isso no se verifica possvel observar uma tonalidade azul no meio intracelular devendose ao facto das clulas no se encontrarem viveis pois as suas barreiras esto destrudas e/ou
danificadas. Desta forma, uma clula vivel ter o seu citoplasma sem qualquer vestgio do
corante e uma clula morta ser facilmente identificvel dada a presena de um tom azul no
seu espao intracelular.
Na utilizao de azul tripano para a contagem de clulas de insecto e animais, neste
caso, clulas animais de mamfero, deve-se ter em conta as caractersticas membranares
especficas dos dois tipos de clulas pois estas podem influenciar a absoro do corante. As
clulas de inseto no tm colesterol na constituio da sua membrana celular, levando a que
tenham membranas mais finas que as clulas de mamferos e o seu espao intracelular por
consequente ser maior. Uma outra diferena fulcral a nvel membranar para compreender a
diferena no manuseamento de clulas de mamferos e de inseto na presena de azul tripano,
o tipo de protenas integradas na membrana celular dos insetos. Como a membrana mais
fina, as protenas que abrangem o espao membranar no necessitam de ser to longas como
as presentes nas clulas de mamferos possibilitando assim diferentes tipos de absoro por
parte destes dois tipos de clulas e nveis de sensibilidade distintos.
De notar tambm que em cultura as clulas de mamferos e clulas de insetos
utilizadas diferem em vrios aspetos: a temperatura a que a cultura submetida, a capacidade
de proliferao e o prprio tipo de cultura. As clulas de mamferos multiplicam-se numa
superfcie aderente a uma temperatura de 37C e tem uma capacidade de proliferao inferior
s clulas de inseto. As clulas de insectos, por sua vez, podem crescer facilmente em
suspenso a uma temperatura de 27C e tm uma taxa de proliferao elevada.
Para procedermos contagem das clulas necessria a utilizao de um
hemocitmetro, instrumento que nos fornece dados precisos no que diz respeito contagem
de clulas por unidade de volume, possibilitando-nos depois fazer uma aproximao para o
nmero real de clulas presentes na mistura original.

O hemocitmetro um dispositivo que consiste num vidro espesso de uma lmina de


microscpio com um corte retangular composto por duas cmaras. As cmaras possuem
diversos quadrados de rea e profundidade conhecida e atravs destas que procedemos
contagem do nmero de clulas. O primeiro passo para garantir que a suspenso de clulas
permanea no espao destinado a utilizao de uma lamela, pois quando aplicada a amostra
no dispositivo, esta preenche completamente a cmara.
Atravs do nmero de clulas contado em cada cmara podemos calcular a
concentrao e a viabilidade celular da amostra atravs dos clculos demonstrados na seco
de resultados.
Assim, este trabalho prtico tem como objectivo a contagem e anlise da viabilidade
celular de culturas de clulas aderentes e em suspenso, utilizando um hemocitmetro,
atravs do mtodo trypan blue exclusion.

Procedimento
Cultura de Clulas
Clulas de Mamfero
Linha Celular
Nmero ATCC
Organismo
Tecido
Morfologia
Propriedades de crescimento
Condies de cultura

HEK 293
CRL-1573
Homo sapiens (Humano)
Rim transformado com adenovrus 5 DNA
Epitelial
Aderente
37C; 5% CO2

Clulas de Inseto
Linha Celular
Sf9
Nmero ATCC
CRL-1711
Organismo
Spodoptera frugiperda
Tecido
Ovrio
Morfologia
Epitelial
Propriedades de crescimento
Aderente/Suspenso
Condies de cultura
27C
Tabela 1 Caractersticas das culturas celulares utilizadas no trabalho prtico.

Materiais e equipamentos
Materiais
Amostras da suspenso das clulas (T-flask- clulas animais e Erlenmeyer-clulas de inseto)
Soluo de PBS (phosphate buffered saline)
Tripsina-EDTA
Meio de cultura: DMEM com 10% FBS e 2 mM L-glutamina
0,1 % de soluo de Trypan Blue em PBS
Pipetas de 5 mL
Pontas de micropipetas descartveis (200 L e 20 L)
Microtubo - Eppendorf de 1,5 mL
Etanol 96% ou 70%
Equipamento
Microscpio Invertido BH-2 de Olympus ou equivalente
Fuchs-Rosenthal hemocitmetro (0,0625 mm2 x 0,200 mm)
Lamela (20 x 26 x 0,4 mm)
Micropipetas (P200 e P20)
Pompete

Procedimento para as clulas de mamfero


1. Pipetar o meio (sobrenadante) do T-flask e descart-lo;
2. Lavar as clulas no T-flask com 1 mL de PBS. Agitar suavemente durante uns segundos e
descartar a soluo;
3. Adicionar 1 mL de Tripsina, agitar suavemente e colocar durante certa de 1 minuto numa
estufa a 37 C;
4. Distribuir a suspenso adicionando 5 mL de meio de cultura ao T-flask;
5. Num microtubo (eppendorf) realizar uma diluio de 1:10 (5 L de meio de cultura com as
clulas; 45 L de soluo de Trypan Blue). Homogeneizar a soluo;
6. Colocar uma lamela no hemocitmetro e cuidadosamente introduzir a soluo preparada no
microtubo (eppendorf) nas duas cmaras at estas estarem preenchidas (~ 20 L/cada);
7. Proceder contagem no microscpio;
8. Limpar com etanol a lamela e o hemocitmetro.

Procedimento para as clulas de inseto


1. Retirar 10 L do meio de cultura das clulas de inseto e colocar num microtubo (eppendorf);
2. Adicionar ao microtubo (eppendorf) 290 L de Trypan Blue realizando assim uma diluio de
1:30. Homogeneizar a soluo;
3. Colocar uma lamela no hemocitmetro e cuidadosamente introduzir a soluo preparada no
microtubo (eppendorf) nas duas cmaras at estas estarem preenchidas (~ 20 L/cada);
9. Proceder contagem no microscpio;
10. Limpar com etanol a lamela e o hemocitmetro.

Segurana e Precaues
Ao pipetar o meio, o PBS ou a Tripsina no T-flask no tocar com a ponta da pipeta na superfcie
que contem as clulas, para que no sejam perdidas. Em situaes normais, seria necessrio trabalhar
num meio totalmente estril.

Trtmento de Resultdos
Clulas de Mamferos
Para calcularmos o nmero de clulas por quadrado do hemacitmetro utilizou-se a seguinte
equao(1):

(1). =
Os clculos para a concentrao celular (nmero de clulas / cm2) procedeu-se conforme as equaes
2, 3 e 4.
(2). = 5000
(3). 252 = 6 (1 + 5 )
(4). 2 =

252
25

O clculo da viabilidade celular realizou-se de acordo com a equao 5.


(5). =

2
2

100 (%)

De seguida apresentado um exemplo da forma como foram realizados os clculos para os vrios
grupos.
Exemplo (grupo 2):
Nmero de clulas viveis por quadrado = 20,6
Nmero de clulas no viveis por quadrado = 0,25
Nmero de clulas totais por quadrado =20,85
2 =

20,85 5 5000 6
= 125100 /2
25

2 =

20,6 5 5000 6
= 123600 /2
25

2 =
=

0,25 5 5000 6
= 1500 /2
25

123600
100 98.8 %
125100

Resultados Obtidos
Mammalian
(HER-293)
(/cm2)

Grupo 1
22,25
0
1:5
133500
0
133500
100

Live
Died
Dilution
viveis
no viveis
totais
viabilidade (%)

clulas/cm2

Grupo 2
20,6
0,25
1:5
123600
1500
125100
98,80096

Grupo 3
26,1
0,5
1:5
156600
3000
159600
98,1203

Grupo 4
9,375
0,25
1:10
112500
3000
115500
97,4026

Tabela 2 Resultados obtidos de todos os grupos de trabalho quanto contagem de clulas de mamferos

Clulas de Insecto
Os clculos para a contagem de clulas de insecto so semelhantes aos utilizados nas clulas
de mamfero. Apenas existem algumas diferenas devido s unidades utilizadas, pois quer-se obter o
nmero de clulas por mL de soluo.
(6.) =

(7.) = 5000 (n clulas /mL)


(8.) =

100 (%)

Exemplo (Grupo 1):


Nmero de clulas viveis por quadrado = 32,5
Nmero de clulas no viveis por quadrado = 0,25
Nmero de clulas totais por quadrado =32,75
= 32,75 5 5000 = 818150 clulas/mL
= 32,75 5 5000 = 812500 clulas/mL
= 32,75 5 5000 = 6250 clulas/mL
=

Insect
(SF9)
(/mL)
clulas/ml

812500

818750

100 99,2%

Live
Died
Dilution
viveis
no viveis
totais
viabilidade (%)

Grupo 1
32,5
0,25
1:5
812500
6250
818750
99,23664122

Grupo 2
17,25
7,875
1:5
431250
196875
628125
68,65672

Grupo 3
34,25
2,875
1:20
3425000
287500
3712500
92,25589

Grupo 4
6,25
0,75
1:30
937500
112500
1050000
89,28571

Tabela 3 Resultados obtidos de todos os grupos de trabalho quanto contagem de clulas de insectos.

Representao Grfica dos Resultados

4000000

Nmero total de clulas

3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
0
1

Grupos de Trabalho
Nmero total de clulas de mamferos

Nmero total de clulas de insecto

Grfico 1 Representao grfica do nmero total de clulas contadas por cada um dos grupos, em que o azul
representa as clulas de mamferos (nmero de clulas/cm2) e o vermelho representa as clulas de insectos
(nmero de clulas/mL).
100
90

Viabilidade Celular (%)

80
70
60
50
40
30
20
10
0
1

Grupos de Trabalho
Viabilidade celular das clulas de mamfero

Viabilidade celular das clulas de inseto

Grfico 2 Representao grfica da viabilidade celular (%) das clulas de mamfero e inseto correspondente a
cada grupo de trabalho.

Discusso
Nos resultados obtidos na contagem de clulas de mamferos, presentes na tabela 1, podemos
verificar que no h diferenas significativas entre os grupos de trabalho, logo no se verifica um
elevado erro associado ao manuseamento dos instrumentos laboratoriais bem como ao procedimento
realizado. Por outro lado, o nico factor que poderia ter sido a causa de variaes nos resultados seria
a diferena de volume inserido em cada cmara do hemocitmetro, pois estes no foram homogneos,
influenciando o n de clulas presente em cada cmara, podendo estar relacionado com o facto de
alguns grupos terem detectado clulas no viveis na sua contagem, enquanto noutros grupos no
aconteceu. Era de esperar que todos os grupos tivessem resultados similares, isto porque as condies
celulares eram idnticas entre grupos e as clulas utilizadas no so to sensveis incluso do corante.
Em relao contagem de clulas de insecto, a densidade celular presente nas culturas
diferente entre si, ou seja, o grupo 1 e 2 usou uma densidade de 0,5, o grupo 3 de 1 e o grupo 4 de 1,5.
Neste caso, apenas podemos comparar os resultados do grupo 1 e 2 j que foram realizados com a
mesma densidade celular, ou seja, em condies semelhantes, em que apenas o operador foi
diferente. Os resultados apresentam diferenas significativas entre os grupos, o que poder ser
explicado pelo tempo de exposio entre a cultura de clulas de insecto e o azul de tripano, j que
estas, devido s caractersticas especficas da sua membrana celular, tendem a absorver o corante ao
fim de pouco tempo de exposio. Desta forma, clulas viveis ficam coradas com o azul. Nestes dois
grupos no era de esperar resultados to discrepantes j que a densidade celular era a mesma. Por
outro lado, para a contagem de clulas necessrio uma lamela que tem como funo conter a
suspenso celular. Caso esta no seja bem aplicada no hemacitmetro, levar a uma menor disperso
celular e consequentemente menor homogeneidade do nmero de clulas por quadrado. de
salientar que o elevado nmero de estudantes que manusearam os instrumentos de laboratrio e que
contaram as clulas leva ainda a uma maior disperso de resultados, bem como do erro associado.

Bibliogrfi
http://www.arbovax.com/our_technology.asp (Outubro 2014)
https://www.phe-culturecollections.org.uk/technical/ccp/cellcounting.aspx (Outubro de 2014)
http://www.hemocytometer.org/2013/04/11/hemocytometer-square-size/ (Outubro de 2014)
Powerpoint solicitado pela Dr Paula Alves

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