Protocolo Prático de Biologia Animal Aplicada

Parte 1
Tripsinização, contagem e plaqueamento de células
HCT116

 Ressuspensão das células por tripsinização;

 Determinar a densidade celular
 Plaqueamento para exposição aos compostos teste

Material necessário:
T25 com células HCT116 (em cerca de 80% de confluência)
pipeta p1000
PBS estéril,
solução de tripsina estéril;
meio de cultura completo (RPMI com 10% de FBS e 1% de mix antibiótico/antimicótico),
tubos Falcon;
camâra de Neubeur (hemocitómetro), contadores manuais
solução de azul de tripano,
placa de 24 poços.

Procedimento:
Tripsinização (necessária para as células que crescem em monocamada)
1. Aquecer previamente meio de cultura RPMI 10% FBS, PBS e solução de tripsina;
2. Observar as células ao microscópio e verificar se apresentam 80-90% de
confluência;
3. Aspirar o meio de cultura. Lavar as células com 1 mL de PBS estéril;
4. Aspirar o PBS do frasco.
5. Colocar 500uL de solução de tripsina e deixar atuar durante aproximadamente
5 minutos agitando para assegurar que toda a superfície está recoberta
uniformemente com a solução de tripsina.
6. Verificar se as células desaderiram do frasco e de seguida adicionar 4.5mL de
meio completo para inactivar a tripsina. Ressuspender as células usando a
pipeta para homogeneizar a suspensão celular;
 7. Depois de ressuspender a suspensão celular retirar 50uL para um eppendorf e
juntar 50uL de solução de azul de tripano. Colocar a lamela na camâra de
Neubauer (hemocitómetro) e pipetar 10uL para fazer a contagem das células.
8. Ajustar a densidade celular a 1x105 células por mililitro e plaquear 500 uL da
suspensção celular para cada poço da placa de 24 poços

9. (Para continuar a cultura adicionar 5mL de Meio Completo a um novo frasco T25
e escrever: nome da linha celular, nº passagem, data e nome e juntar cerca de
2.5x105 células.)

Contagem das células com camâra de Neubauer

 Transferir 10uL da suspensão celular para um eppendorf estéril;

 Adicionar 10uL da solução de Azul de Tripano (diluição 1:1);
 Pipetar 10uL da suspensão do passo anterior na camâra de Neubauer;
 Contar o número de células viáveis (brilhantes) e não viáveis (azuis) em cada
campo da camâra.

Para calcular a concentração de células viavéis presentes na suspensão celular:

(média do número de células viáveis nos 4 campos) x 104 x 2 (factor de diluição)

1mm

1mm

 Contar 4 quadrados, fazer a média;

 Multiplicar pelo factor de diluição
 Multiplicar pelo volume da camâra (1 x 104)

Volume camâra = 1mm2 x 0,1mm (altura do poço da camâra)

= 0,1mm3
Como 1mm3 corresponde a 0,001mL, 0,1 mm3 são 0,0001mL ou seja 1 x 10-4mL.
Para saber o número de células por mililitro temos que multiplicar a média do número
de células presentes nos 4 quadrantes do hematocitómetro por 104 e por 2 (fator de
diluição correspondente à adição de azul de tripano).
A densidade celular que desejamos é de 1x105 células por mililitro. Para obter esta
densidade usar a fórmula CixVi=CfxVf. O volume final de suspensão celular que
necessário preparar por placa de 24 poços são 15 ml (12 mais algum volume para erros
de pipetagem).

Exemplo: A média do número de células nos 4 campos do hemocitómetro foi de 120

células. Com os cálculos para o número de células por mililitro obtivemos 240x104
células por mililitro. Este valor corresponde ao Ci. A concentração final que desejamos
é de 1x105 células por mililitro (Cf) e o volume final (Vf) são 15ml. Assim, o volume da
suspensão inicial que desejamos pipetar para um tubo Falcon de 15ml para preparar a
nossa suspensão com a densidade celular desejada é de:
1x105x15/24x105 = 15/24= 0,625mL
Aos 0,625uL de suspensão celular teremos que adicionar meio até 15mL, isto é,
temos que adicionar 14,375mL de meio.
Tapar o tubo Falcom e inverter cuidadosamente algumas vezes para homegeneizar a
suspensão

Plaqueamento (e incubação)
Pipetar 0,5mL da suspensão celular para cada um dos poços de uma placa de 24 poços
e deixar na incubadora a aderir durante 24h (ou 48h).

Passado este tempo é necessário substituir o meio com meio contendo os extratos a
testar nas concentrações pretendidas.