Repique das clulas Meio de cultura: DEMEM 10% SBF + antibiticos (BJ fibroblasto humano, NTera-2 carcinoma embrionrio

io humano), McCoys + 10% SBF + antibiticos (Tera-1 e Tera-2). Obs.: o meio de cultura, o PBS e a tripsina devem estar em temperatura ambiente para a realizao dos experimentos. Passos para o repique: 1- Retirar o meio de cultura com uma pipeta de 10 mL e dispensar no descarte de lquidos (utilizar uma pipeta para cada tipo de linhagem ou tratamento); 2- Com uma pipeta, pegar 5 mL de PBS para lavar as garrafas (retirar o excesso de meio de cultura para que a tripsinizao ocorra corretamente); 3- Retirar o PBS e desprezar no descarte de lquidos; 4- Com uma pipeta, pegar 3 mL de tripsina de uso e incubar as culturas por 3 min. a 37C (na estufa); 5- Inativar a tripsina com 3x o volume de meio de cultura (9 mL de meio de cultura com SBF) e transferir o contedo para um tubo falcon; 6- Centrifugar o material a 1500 RPM por 10 min.; 7- Desprezar o sobrenadante e desfazer o pellet; 8- Adicionar 1 mL de PBS ou meio de cultura e contar o nmero de clulas (se necessrio). Contagem de clulas: Para se fazer a contagem de clulas, deve-se utilizar uma pequena alquota da suspenso celular (10 uL) e diluir em soluo de Tukey. A diluio vai depender da quantidade de clulas. A contagem deve ser realizada nos 4 maiores quadrantes da cmara de Neubauer. O nmero total deve ser dividido por 4 (mdia) e ento multiplica-se por valor da diluio e por 104. O resultado vai informar o nmero de clulas por 1000 uL (1 mL).