Protocolo de Extrao

1 . Coletar as amostras de folhas jovens e saudveis das plantas, evitando reas

atacadas por pragas e doenas.
2. Lavar as folhas em gua.
3. O material ser transferido para um cadinho e adicionado cerca de 1.5 mL de
tampo de extrao:
10 ml
3% CTAB 0,3 g do produto
1.4 M NaCl 2,8 ml do estoque 5 M NaCl
100 mM Tris-HCl (pH 8,0) 1 ml estoque 1 M Tris Cl pH
8,0
20 mM EDTA, pH 8,0 400 l do estoque 0,5 M EDTA, pH
8,0
3% polivinilpirrolidona MW10,000 0,3 g do produto

Adicionar 1 % de -mercaptoetanol ao tampo a ser usado pouco antes do uso.

4. Misturar os tubos em vrtex, e coloc-los em banho-maria a 65oC por 30 minutos.

5. Adicionar 500 l de clorofrmio:lcool isoamil (24:1) e misturar at formar uma
emulso.
6. Microcentrifugar a soluo por 10 minutos a 10000 rpm.
7. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para no
pipetar a interfase.
8. Repetir esses trs passos anteriores caso seja necessrio.
9. Adicionar um volume igual de isopropanol gelado.
10. Centrifugar o DNA por 10 minutos a 12.000 rpm.
11. Lavar o pellet com 1 ml de Etanol 70% para remover sais por duas vezes, e secar ao
ar.
12. Ressuspender o DNA em 50 l de tampo TE contendo ribonuclease [RNAse]
(10mg.ml-l) e incubar por 30 minutos a 37C.