Biologia Celular 1ºano FFUL 2023-2024

Objetivo:
Introduzir os conceitos de cultura de células de mamífero. No final desta aula o aluno
deve ser capaz de:

 Tripsinizar células de mamífero;

 Contar células numa câmara de contagem;

 Calcular a concentração celular numa suspensão de células;

 Determinar a percentagem de morte celular utilizando o método de exclusão

de azul de tripano;

 Criar um gráfico com os dados experimentais obtidos no laboratório.

Curiosidades:
Tal como já falamos nas aulas teóricas a linha celular HeLa foi estabelecida em 1951 a partir de uma
biópsia de um tumor cervical retirado da Sra. Henrietta Lacks, uma mulher afro-americana da classe
trabalhadora que vivia perto de Baltimore. A biópsia foi efetuada sem o seu conhecimento, ou
permissão da sua família, e as células com um elevado potencial proliferativo tornaram-se na primeira
linha celular de células humanas a crescer em um laboratório.

Os estudos efetuados com base nestas células contribuíram para o desenvolvimento de uma vacina
contra a poliomielite, para a descoberta da telomerase humana entre outros (Lucey et al., 2009). Uma
pesquisa feita em Outubro de 2021 no PubMed por "HeLa" revelou mais de 116 000 artigos.

As células HeLa crescem em Meio Essencial Mínimo de Eagle, suplementado com de soro fetal bovino,
glutamina e antibióticos. O pH do meio é mantido numa atmosfera com CO2 a 5% em atmosfera
húmida. As células crescem em monocamada, aderentes à superfície do frasco/ placa de cultura. A
sub-cultura das células faz-se habitualmente a partir de culturas confluentes. As células são
subcultivadas, a partir de suspensões celulares obtidas por tripsinização das células da monocamada.

Materiais:
Células HeLa (ATCC, CCL-2)
Meio Essencial Mínimo de Eagle
0.05% (w/v) solução de tripsina-EDTA
Soro fetal bovino
2mM L-Glutamina
100 g/ mL Penicilia
100 g/ mL Estreptomicina
Tampão fosfato salino (PBS – Phosphate Buffer Saline)
Azul de tripano 4%
Etanol a 25% em PBS e etanol a 50% em PBS.
Câmara de Neubauer
Lamelas
Pipetas Pasteur descartáveis
Microtubos de 2mL e de 1.5 mL
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Protocolo experimental:
Todas as operações envolvidas no manuseamento das células e respetivos meios
são efetuadas normalmente em condições de assepsia, com material estéril, e em
câmara de fluxo laminar.

Na véspera da aula, foram plaqueadas 1x106 células HeLa numa placa de Petri (de 6
cm), específica para cultura de células, nas condições acima descritas.

Passo 1 – Tripsinização das células

1. Observe a placa com a cultura de células HeLa por microscopia de
contraste de fase;

2. Remova o meio de cultura da placa de Petri utilizando uma pipeta Pasteur

descartável;

3. Adicione 1 mL da solução 1x PBS, agite suavemente a placa e remova a

solução com a mesma pipeta. Repita o processo mais uma vez;

4. Adicione 300 L da solução de tripsina-EDTA e agite suavemente a placa

de forma que todas as células fiquem cobertas com a solução;

5. Incube a placa 10 min, à temperatura ambiente, agitando ocasionalmente.

As células irão começar a soltar-se da placa;

6. Adicione 1 mL da solução 1x PBS para diluir e assim neutralizar a atividade

proteolítica da tripsina, e ressuspenda as células, utilizando a pipeta
Pasteur. Pipete up and down 15x;

7. Transfira a suspensão de células para um microtubo de 2 mL utilizando a

pipeta Pasteur.

Passo 2 - Tratamento com um composto tóxico

As taxas de sobrevivência celular podem ser afetadas por diversos factores, como a
a temperatura, o pH, a concentração salina e a exposição a tóxicos. Nesta aula, irá
testar o efeito de diferentes concentrações de etanol na sobrevivência celular
das células HeLa.

8. Marque 2 microtubos de 1,5 mL. (Idealmente seriam 3 réplicas por tratamento);

9. Distribua com a pipeta Pasteur 100 µl da suspensão celular por tubo. Agite
suavemente;
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10. No tubo controlo adicione 100 µl 1x PBS. No tubo de teste adicione 100 µl da
solução etanol diluída em PBS (25% etanol ou 50% etanol);

11. Incube os tubos 20 minutos à temperatura ambiente.

Passo 3 - Contagem das células mortas na suspensão celular

Apesar dos mais recentes desenvolvimentos tecnológicos e científicos, a câmara de
Neubauer continua a ser o método mais comum para a contagem de células.
Esta consiste numa lâmina de vidro, que contém 2 câmaras com uma de depressão
central (profundidade de 0.01 cm). Esta zona de contagem possui 9 quadrados
maiores 1, com dimensões 1x1 mm, o que perfaz uma área total de 3x3 mm de área
de contagem. Os 4 quadrados dos cantos da grelha estão divididos em 16 quadrados
mais pequenos, tipicamente utilizados para a contagem de leucócitos. O quadrado
central está dividido em 400 quadrados mais pequenos, agrupados em 25 conjuntos
de 16 quadrados, que tipicamente são utilizados para a contagem de eritrócitos e
plaquetas, respetivamente. Na Figura seguinte corresponde à grelha de contagem de
uma câmara de Neubauer.

Figura 1: Representação esquemática da câmara de Neubauer

O teste de exclusão do corante azul de tripano é utilizado para determinar o número

de células mortas presentes numa suspensão celular.

É baseado no princípio de que as células vivas possuem membranas celulares

intactas que excluem certos corantes (e.g. azul de tripano), enquanto as células
mortas não. Este método representa uma técnica simples e rápida para quantificar
morte celular, através da análise da integridade da membrana celular.

Nota: é, ainda, possível que a viabilidade de uma célula possa estar comprometida, mesmo
que a integridade de membrana seja mantida (pelo menos temporariamente). Por outro lado,
a integridade da membrana celular pode estar afetada, mas a célula poderá ainda ser capaz
de reparar o dano.
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12. Pipete 200 L de azul de tripano 4% para cada um dos tubos com as amostras;

13. Incube durante 2 minutos;

14. Agite bem a suspensão celular. Carregue 10L de cada uma das amostras
(amostra controlo e amostra tratada com a solução de etanol), para cada uma das
câmaras.

15. Conte o número total de células, bem como o número de células azuis nos 4
quadrados assinalados com o algarismo 1 na Figura 1.

16. Ajuste a objetiva do microscópio para 10X de forma a focar num o quadrado
central.

Células azuis escuras = células mortas

Células claras = células vivas
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Figura 2: Contagem de células numa câmara de Neubauer. A) Devem ser contadas células que tocam
os limites superior e esquerdo de cada um dos quadrados. B) Contagem em zig-zag.

Nota: Cada laboratório adota protocolos de contagem diferentes. No entanto, existe uma
regra não escrita em que sugere que: para células que se encontrem nos limites dos
quadrados, sejam contadas apenas as células que tocam os limites superior e esquerdo de
cada um dos quadrados, e não as células que tocam os limites inferior e direito (Figuras 2A).
Esta regra evita, assim, a contagem em duplicado de algumas células. No caso de existir um
elevado número de células na câmara, será mais fácil contar as células em zig-zag (Figura
2B).

Cada quadrado 1 da grelha, representa um volume total de 10-4 cm3. Uma vez que 1
cm3 é equivalente a 1 mL, a concentração de células por mL ou o número total de
células será determinada utilizando os seguintes cálculos:

 Concentração celular (nº células/ mL) = número de células vivas x 104 x 2

(1ºFator de Diluição) x 2 (2ºFator de Diluição)

 Número total de células na placa de cultura = número de células vivas x

104 x 2 (Fator de diluição) x 2 (2ºFator de Diluição) x 1.3 (volume final)

 Percentagem de morte celular (%) = número de células mortas/ número

total de células x 100

Bibliografia:
Lucey BP, Nelson-Rees WA, Hutchins GM. Henrietta Lacks, HeLa cells, and cell culture
contamination. Arch Pathol Lab Med. 2009 Sep;133(9):1463-7. doi: 10.5858/133.9.1463.
PMID: 19722756.